基于SMRT测序技术的塔里木马鹿冬季肠道菌群多样性分析.pdf
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1、 Chinese Journal of Wildlife 2024,45(1):58-66Chinese Journal of Wildlifehttp:/基于SMRT测序技术的塔里木马鹿冬季肠道菌群多样性分析祁程1,姜李欢1,阿卜杜萨拉木 努尔麦麦提1,王开彦2,单文娟1,钟林强1*(1.新疆大学生命科学与技术学院,新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐,830017;2.新疆沙雅县林业和草原局,沙雅,842200)摘 要为探究塔里木河流域塔里木马鹿(Cervus elaphus yarkandensis)冬季肠道菌群群落结构、多样性与功能,采用PacBio平台的单分子实时测序技术(sin
2、gle molecule real-time sequencing,SMRT)对塔里木河上游湿地自然保护区采集并筛选的25份塔里木马鹿粪便样本的 16S rRNA 基因全长进行测序,共获得 298 578个 clean reads,clean reads聚类获得28 026个OTU,包括25门684属。Alpha多样性分析结果显示,塔里木马鹿冬季肠道菌群Shannon指数为(7.7640.044),Simpson指数为(0.0150.001),Chao1指数为(12 242.668695.106),ACE指数为(9 366.423407.612)。塔里木马鹿优势菌门为厚壁菌门(Firmicut
3、es,60.51%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,26.02%)、变形菌门(Proteobacteria,3.61%)、疣微菌门(Verrucomicrobia,1.57%)和浮霉菌门(Planctomycetes,1.46%)。相对丰富度在前10的菌属为Papillibacter(5.48%)、拟杆菌属(Bacteroides,5.12%)、Muribaculum(4.69%)、Phocaeicola(4.49%)、Lawsonibacter(4.31%)、瘤胃球菌属(Ruminococcus,4.09%)、Intestinimonas(3.06%)、普氏菌属(Prevotella
4、,2.87%)、克里斯滕森菌属(Christensenella,2.71%)和弯曲杆菌属(Campylobacter,2.54%)。PICRUSt 16S功能预测结果表明,塔里木马鹿肠道菌群基因功能主要富集于新陈代谢(48.58%)、遗传信息处理(19.04%)和环境信息处理(12.08%);其中新陈代谢主要以碳水化合物代谢(9.47%)、氨基酸代谢(9.93%)为主,并且环境信息处理的膜转运(9.96%)基因相对丰富度最高。研究揭示了野生塔里木马鹿冬季肠道菌群特征和功能,为塔里木马鹿野生种群的保护提供基础数据。稿件运行过程收稿日期:2023-02-23修回日期:2023-04-05关键词:塔
5、里木马鹿;肠道菌群;单分子实时测序(SMRT);PICRUSt功能预测Key words:Tarim red deer(Cervus elaphus yarkandensis;Gut microbiota;Single molecule real-time sequencing;PICRUSt function prediction中图分类号:Q938文献标识码:A文章编号:2310-1490(2024)-01-0058-09DOI:10.12375/ysdwxb.20240108基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2022D01C657);新疆大学科研启动项目(620321053);
6、新疆大学自治区级大学生创新训练计划项目(S202210755079)第一作者简介:祁程(1997),男,硕士研究生;主要从事有蹄类动物营养生态学研究。E-mail:*通信作者:钟林强,E-mail:祁程等:基于SMRT测序技术的塔里木马鹿冬季肠道菌群多样性分析第1期Analysis of Gut Microbiota Diversity of Tarim Red Deer in Winter Based on the SMRT SequencingQI Cheng1,JIANG Lihuan1,ABDUSALAMU Nurmamati1,WANG Kaiyan2,SHAN Wenjuan1,Z
7、HONG Linqiang1*(1.Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi,830017,China;2.Forestry and Grassland Bureau of Shaya County,Shaya,842200,China)Abstract:The Tarim red deer(Cervus elaphus yarkandensis)is the o
8、nly subspecies of red deer that has adapted to the desert habitat in China.However,there is limited knowledge about how the gut microbiotas structure and function of wild Tarim red deer adapted to desert plants.This study analyzed the gut microbiota of 25 fecal samples obtained from Tarim red deer l
9、ocated in the Upper Tarim River Nature Reserve using the PacBio single molecule real-time sequencing(SMRT)technique.A total of 298,578 clean reads were obtained and clustered into 28,026 OTU,belonging to 25 phyla and 684 genera.Alpha diversity analysis yielded Shannon index of(7.7640.044),Simpson in
10、dex of(0.0150.001),Chao1 index of(12,242.668695.106),and ACE index of(9,366.423407.612).The dominant phyla in the gut microbiota of Tarim red deer were Firmicutes(60.51%),Bacteroidetes(26.02%),Proteobacteria(3.61%),Verrucomicrobia(1.57%),and Planctomycetes(1.46%).At the genus level,Papillibacter(5.4
11、8%),Bacteroides(5.12%),Muribaculum(4.69%),Phocaeicola(4.49%),Lawsonibacter(4.31%),Ruminococcus(4.09%),Intestinimonas(3.06%),Prevotella(2.87%),Christensenella(2.71%),and Campylobacter(2.54%)were the top 10 bacteria.PICRUSt analysis revealed that the predicted gene functions of the Tarim red deer gut
12、microbiota were mainly in metabolism(48.58%),genetic information processing(19.04%),and environmental information processing(12.08%).Carbohydrate metabolism(9.47%)and amino acid metabolism(9.93%)were the main categories of metabolism,while membrane transport(9.96%)was the most enriched gene category
13、 of environmental information processing.This study provided the first insight into the characteristics and functions of the gut microbiota of wild Tarim red deer,which may serve as a basis for wild population conservation.塔里木马鹿(Cervus elaphus yarkandensis)是栖息于塔里木河流域的典型荒漠有蹄类动物,国家一级重点保护野生动物。由于栖息地丧失与破
14、碎化,现存塔里木马鹿种群数量降低、近亲繁殖严重、遗传多样性及种群生存力降低,野生种群已经下降到450只左右,处于极度濒危状态,形成了3个相对孤立种群(沙雅种群、尉犁种群和且末种群)12。近年来,关于野生塔里木马鹿的研究主要集中于生境选择与利用3、环境适应性4与保护遗传学研究56,但对于野生塔里木马鹿肠道菌群多样性及功能的研究尚未见报道。野生有蹄类动物肠道菌群所发挥的功能作用与宿主营养吸收和代谢、免疫防御等具有密切关系7,而肠道菌群会受生境8、食性9和季节10等因素的影响,其中,食性是影响肠道微生物的主要因素1112。沙雅县塔里木河上游湿地自然保护区冬季可食用荒漠植物种类少,植物营养成分含量低、
15、盐碱含量高,塔里木马鹿可能面临极端干旱荒漠生境中的营养和能量限制。长期生活在极端干旱环境下,塔里木马鹿逐渐适应芦苇(Phragmites australis)13、胡杨(Populus euphratica)和胀果甘草(Glycyrrhiza inflata)14等荒漠植物,对高盐碱性、带刺、木质化及有特别气味的植物产生了适应性,对营养质量差、粗纤维含量高的荒漠植物具有很高的能量利用率14。因此,了解塔里木马鹿冬季肠道菌群的多样性和功能对于理解肠道菌群协助宿主适应荒漠植物的机制具有重要意义。当前,野生动物肠道菌群研究常采用Illumina高59野 生 动 物 学 报第45卷通量测序平台对菌群1
16、6S rRNA基因的V3V5区进行测序,但该技术测序读长短,准确度相对较低,随着PacBio第三代测序平台的发展,单分子实时测序(single molecule real-time sequencing,SMRT)技术能够为16S rRNA基因全长序列的微生物组研究提供更精准、更全面的信息15。16S rRNA基因全长测序具有读长更长、准确性高、无引物偏差和更高的物种分辨率等优点,已广泛运用于高质量微生物群落分析16。因此,本研究采用PacBio平台单分子实时测序技术,分析新疆塔里木河上游湿地自然保护区的塔里木马鹿冬季肠道菌群的组成与多样性,并利用PICRUSt软件对肠道菌群基因进行功能预测,
17、为后期野生塔里木马鹿保护与研究提供基础数据。1研究方法1.1研究区概况塔里木河上游湿地自然保护区位于新疆维吾尔自治区阿克苏地区沙雅县(39314125 N,81458447 E),处于塔里木盆地北部,塔克拉玛干沙漠向沙雅绿洲的过渡地带,塔里木河流域中上游,总面积为31 972.5 km2,降水稀少,极端干旱,炎热,该保护区植物种类主要是超旱生半乔木、旱生、盐生的灌木及小半灌木占优势的荒漠植物,主要保护对象为塔里木马鹿、鹅喉羚(Gazella subgutturosa)等濒危野生动物及荒漠河岸胡杨林。1.2样品采集2022年12月,在保护区通过样线调查采集塔里木马鹿冬季新鲜粪便样品,塔里木马鹿粪
18、便呈堆状,通过粪便形态和大小来区分塔里木马鹿和鹅喉羚,为了避免杂菌污染,使用PE手套采集内部粪粒,放入100 mL EP管中,-20 短期保存,-80 长期保存。共采集178份粪便样本(图1),成功提取132份粪便样本 DNA,利用 5对微卫星分子标记(BM888、BM4208、BM5004、BM6438、BM6506)对粪便DNA进行扩增,其中59份样品全部微卫星扩增成功,使用Cervus 3.0进行个体识别,结果显示59份粪便DNA属于54只个体,从中筛选25份不同个体的粪便样品用于16S rRNA基因全长测序。1.3粪便DNA提取与PCR使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit(Om
19、ega Bio-Tek,Norcross,GA,U.S.)试剂盒提取粪便样本中的微生物组总 DNA。采用 16S rRNA 基因全长通用引物27F 5-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3和1492R 5-RGYTACCTTGTTACGACTT-3进行 PCR扩增。PCR图1冬季塔里木马鹿粪便采样点分布Fig.1 Geographic locations of fecal sample of Tarim red deer in winter60祁程等:基于SMRT测序技术的塔里木马鹿冬季肠道菌群多样性分析第1期反应体系20.0 L:4.0 L 5FastPfu缓冲液,2.0 L 2.5
20、 mmol/L dNTPs,上、下游引物各0.8 L(5.0 mol/L),0.4 L FastPfu聚合酶,10 ng模板DNA,使用双蒸水补充至 20 L。PCR 反应条件:95 预变性 2 min;95 变性 30 s,55 退火 30 s,72 延伸 1 min,共 35个循环;最后72 终延伸5 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,U.S.)试剂盒参照说明书操作流程纯化。参照电泳初步定量结果,将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系
21、统(Promega公司)检测定量,之后按照每个样品的测序量要求进行相应比例混合。1.416S rRNA基因全长测序与数据统计分析根据制造商的说明书制备SMRT bell文库后,在PacBio Sequel 上 测 序,获 得 raw reads。使 用UPARSE(7.1 版,http:/ OTU按照98.65%的相似性阈值聚类,并使用UCHIME去除嵌合序列,获得clean reads。所有扩增子测序均由上海凌恩生物科技有限公司承担。对clean reads进行 OTU 划分,并绘制韦恩图。Alpha 多样性通过Mothur 软件计算 ACE 指数、Chao1 指数、Shannon 指数、S
22、impson 指数和 Coverage 指数,并绘制 Shannon-Wiener 曲线验证测序深度的合理性。然后通过与16S数据库(Silva)对比进行物种组成分析,获得各个样品所具有的所有菌群及比例,并使用R中reshape2和 ggplot2 包绘制门、属水平的堆叠图。使用 vegan包进行基于Bray-Curtis的非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling,NMDS)。最后,使用PICRUSt软件对塔里木马鹿肠道菌群基因进行功能预测,将标准化后的OTU丰度表与KEGG数据库比对,再使用R中reshape2和ggplot2包对基因注释结果
23、进行可视化。2结果2.116S rRNA基因全长测序通过对 16S rRNA 基因测序数据分析,共获得298 578 条 clean reads,每个样品平均 clean reads 为11 943条,平均长度为1 459 bp,基于98.65%的相似度聚类 28 026 个 OTU,平均每个样品含有 1 121 个OTU,其中核心 OTU数量为 178(图 2)。Alpha多样性分析结果显示,塔里木马鹿肠道菌群Shannon指数为(7.7640.044),Simpson 指数为(0.0150.001),Chao1 指数为(12 242.668695.106),ACE 指数为 (9 366.4
24、23407.612)(表1),可见个别样本的肠道菌群多样性有一定的差异。塔里木马鹿肠道菌群Shannon-Wiener曲线随着测序深度的增加,曲线逐渐上升并趋于平稳,继续增加测序深度,菌群多样性也 不 会 有 显 著 变 化,说 明 测 序 数 据 可 靠 性 较高(图3)。图2塔里木马鹿肠道菌群OTU韦恩图Fig.2 Venn diagram of core OTU of gut microbiota of Tarim red deer图3冬季塔里木马鹿肠道菌群Shannon-Wiener稀释曲线Fig.3 Rarefaction curve of Shannon-Wiener index
25、of gut microbiota of Tarim red deer in winter61野 生 动 物 学 报第45卷2.2物种群落结构分析根据门、属两个分类水平,25个样品共获得25个菌门和 684 个菌属。在门水平上,相对丰度前 10的菌门分别是厚壁菌门(Firmicutes,60.51%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,26.02%)、变形菌门(Proteobacteria,3.61%)、疣 微 菌 门(Verrucomicrobia,1.57%)、浮霉菌门(Planctomycetes,1.46%)、Candidatus Saccharibacteria(0.64%)、螺
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