等温扩增技术应用于虾肝肠孢虫检测的研究进展.pdf
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1、 渔业研究,():收稿日期:基金项目:重庆市教委科学技术研究项目()作者简介:谭念秋(),女,硕士研究生,研究方向:病原微生物。:通信作者:范晓东(),男,博士,研究方向:病原微生物。:谭念秋,魏春梅,文钰淞,等 等温扩增技术应用于虾肝肠孢虫检测的研究进展 渔业研究,():等温扩增技术应用于虾肝肠孢虫检测的研究进展谭念秋,魏春梅,文钰淞,范晓东(重庆师范大学生命科学学院,重庆)摘要:虾肝肠孢虫(,)是一种专性细胞内寄生虫,其大面积的暴发使对虾养殖业遭受巨大的经济损失,且目前尚未发现有效治疗 感染的特效药。的检测手段主要包括组织病理学和分子生物学,其中属于分子生物学领域的等温扩增技术因具有简便性
2、、低成本、较高的灵敏度和特异性等特点而成为潜在的田间检测方法。本文对 的常规检测方法进行综述,对环介导等温扩增技术和重组酶等温扩增技术及其在 检测中的应用进行重点介绍,以期为 感染的早期检测及高效防控提供参考,促进对虾养殖业的健康发展。关键词:虾肝肠孢虫;等温扩增;检测;环介导等温扩增;重组酶等温扩增中图分类号:文献标识码:文章编号:()目前,对虾养殖业是世界水产养殖的重要组成部分,产值超过 亿美元。但在养殖过程中,对虾一直受到各种病原(真菌、细菌、病毒、寄生虫等)的威胁,如虾肝肠孢虫(,)等。隶属于肠孢虫属(),是一种专性细胞内寄生虫,主要感染对虾肝胰腺上皮细胞,传播途径可分为水平传播和垂直
3、传播。从幼虾到成虾的各成长阶段均会感染,虽然感染后的对虾不会死亡,但会出现摄食减少、生长缓慢等病症。目前尚无有效治疗 感染的特效药,导致该病难以防治,给养殖户造成了极大的经济损失,严重影响了对虾养殖业的发展,如 年印度对虾产业因受 感染,年产量减少 ,经济损失达数千万美元。近年来,在中国、委内瑞拉、泰国、马来西亚、越南等国家大面积暴发,在尚未发现有效治疗 方法的情况下,对其进行预防检测就显得尤为重要。的检测手段主要包括组织病理学检测和分子生物学检测,其中属于分子生物学检测领域中的等温扩增技术因具有简便性、低成本、较高的灵敏度和特异性等优点而成为重要的田间检测技术。为此,本文拟对 的常规检测方法
4、进行综述,重点介绍环介导等温扩增(,)和 重 组 酶 等 温 扩 增(,)检测技术及其在 检测中的应用,以期能在 感染早期进行阳性筛查,为 的高效防治提供理论参考。的检测方法在 感染早期,宿主无明显、特定的病理特征,因此无法通过直观视觉诊断 感染,需要借助现有的光学仪器设备及相关的分子检测渔业研究第 卷手段。目前,的检测方法主要包括组织病理学、原位杂交以及分子生物学等。组织病理可通过光学显微镜、相差显微镜对感染的组织切片进行观察,而各种染色技术的应用则使感染肝胰腺组织中的 能被更清晰地观察到。但组织病理学观察适用于感染后期,感染早期的组织切片因无明显感染的组织学迹象,容易产生漏检而导致检测人员
5、错误判断,如 等研究发现,组织病理学观察无法判断是否感染了微孢子虫,但其核酸检测为强阳性。等利用荧光染色剂钙荧光白(,)对 进行检测,结果表明其可快速检测悬液、粪便中的 孢子,但该方法特异性和灵敏度较差。组织病理学观察适用范围有限,容易造成假阴性,只能作为辅助性的 检测方案。原位杂交常作为一种辅助组织病理检测的手段而被应用于 的检测。如 等利用地高辛标记探针,开发了一种用于 检测的原位杂交方法,其具有良好的灵敏度和特异性。但该方法操作复杂,无法在现场进行快速检测,需在实验室条件下进行使用。的分子生物学检测技术主要包括聚合酶链式反应(,)、实时 荧 光 定 量 (,)、等温扩增方法(和)、数字
6、等。是世界动物卫生组织方案中概述的许多虾病诊断的金标准,在 检测中常用的方法主要有巢式 和一步法。目前,在 的检测中,研究者常用 和 等基因作为检测靶标。其中 作为检测靶标是早期主要的 检测方法,但存在特异性低等问题,而现在的研究以 和 等为检测靶标,有效地提高了 检测的特异性。汪浩等基于 孢壁蛋白建立了荧光定量检测体系,该方法在 范围内具有良好的线性关系;马来等研发了基于 探针的荧光定量检测方法,对虾样品的检测下限为 ;等建立了灵敏、准确的双链液滴数字 ()方法,可以同时检测和定量两种病原体,其中 的检测下限为 ,极大地提高了检测灵敏度。采用、荧光定量 以及数字 检 测 时,需要借助聚合酶链
7、反应核酸扩增仪、数字 检测仪等仪器,因而只能在实验室进行检测,无法在田间进行快速检测。等温扩增技术是基于传统分子生物学方法而发展起来的,通过水浴锅、恒温仪等设备,在恒温条件下快速放大目的基因,操作简单,具有发展为快速高效的现场检测方法的潜力。目前用于 的等温检测技术主要包括 和 等。陈进会等基于基因建立了检测 的 检测方法;黄纪徽等分别以 的 和 为靶标建立了实时荧光 检测方法。随着科技发展,研究人员对以上检测方法进行了持续改良,以期寻找到特异性强、灵敏度高的方法,但各种技术手段都存在明显的优缺点(表),在进行检测时,应根据需求选择最佳的实验方法。等比较了几种检测 的 技 术,其 中 巣 氏、
8、的灵敏度最高,各种检测技术的特异性与靶标基因相关,其中和 基因的特异性最佳,而组织病理学的灵敏度和特异性相对较差,因此靶标基因的选择与实验技术的改良同等重要。等温扩增技术的研究进展等温扩增技术的反应过程始终保持恒温状态,通过添加不同活性的酶和特异性引物达到快速扩增核酸的目的,因其具有高灵敏度、高特异性、低成本、操作方便等特点而被广泛应用于检测食源性和环境病原体,但 和 并未被大范围应用。随着对交叉学科研究的增多,研究者结合荧光染料、探针等手段对 和 的方法进行改良,拓展了其应用领域。研究进展 是一种能在恒定温度下,利用特异性引物和具有链置换特性的 聚合酶快速扩增的技术,具有低成本、检测操作简单
9、快捷、特异性强和灵敏度高等特点,是能够被推广 第 期谭念秋等:等等温温扩扩增增技技术术应应用用于于虾虾肝肝肠肠孢孢虫虫检检测测的的研研究究进进展展并应用到田野上的检测技术。常规的 存在较多的缺点,如扩增后产物不易被分析、缺乏特异性高且成本较低的染料、扩增产物容易造成气溶胶污染、导致假阳性等。表 常规的检测技术比较 检测技术 优点缺点检测环境 组织病理学易观察、直观操作繁琐、灵敏度差、易漏检、易误诊实验室聚合酶链式反应()操作简单、金 标 准、成 本低、适合大样本检测检测下限较高实验室巢氏 灵敏度较高、特异性较好、操作简单假阳性实验室实时荧光定量 定量分析、可重复、可分析感染程度成本较高实验室数
10、字 精确检测、定量成本高、仪器昂贵实验室原位杂交 直观、反映感染位置及组织感染程度费时、繁琐实验室环介导等温扩增 简便、快速引物设计难、易假阳性实验室、田间重组酶等温扩增 简便、快速、检测下限低易出现非特异性扩增实验室、田间 为弥补 的不足,研究者们将各种染料加入 反应中,等通过在 体系中加入显色灵敏的金属指示剂羟基萘酚蓝(),建立了一种快速可视化检测金黄色葡萄球菌的方法,这是一种有巨大潜力的快速诊断金黄色葡萄球菌感染的技术手段。常规的 检测只关注基因扩增后的结果,而荧光实时定量方法不仅可以实时观察基因扩增情况,且可以对基因进行定量分析,能更加直观地获得实验数据。等在环引物的 端连接了一个羧基
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