西印度洋产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性初步研究.pdf
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1、第 卷 第 期应 用 海 洋 学 学 报,年 月 ,西印度洋产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性初步研究吴旭东,童 凡,夏钰华,黄仕新,黄家琪,徐长安,唐 旭 收稿日期:资助项目:亚洲合作基金();厦门南方海洋研究中心项目()作者简介:吴旭东(),女,硕士研究生;:通讯作者:唐旭(),男,正高级工程师;:;徐长安(),男,正高级工程师;:(自然资源部第三海洋研究所,福建 厦门;上海海洋大学海洋科学学院,上海;福州大学生物与科学工程学院,福建 福州)摘要:本研究从西印度洋表层沉积物中筛选获得 株高抗性、稳定性好的纤维素酶高产菌株,通过形态学、革兰氏染色、生理生化鉴定以及 基因序列分析对菌株进行分类鉴定
2、,并研究了其酶学特性。结果表明,菌株 为漳州芽孢杆菌(),具有较高的产纤维素酶能力。酶学特性研究表明,该菌株所产纤维素酶的最适反应温度为 ,最佳 为,该条件下发酵 后粗酶液酶活力为()。在 及 为 时酶活性稳定性较高,、对该酶活性有一定的促进作用,对其酶活性具有抑制作用。综上,漳州芽孢杆菌 是一株高产纤维素酶菌株,所产纤维素酶具有良好的耐热性和一定的酸碱耐受性,具有潜在的产业应用开发价值。关键词:海洋生物学;海洋细菌;漳州芽孢杆菌;筛选;纤维素酶;酶学特性:中图分类号:文献标识码:文章编号:()纤维素是自然界最丰富和最有用的天然可再生资源,利用纤维素可以生产酒精、气体燃料和可降解材料等,有助于
3、解决当下面临的能源危机、粮食短缺和环境污染等问题。然而纤维素是一种较难催化降解的由葡萄糖组成的大分子多糖,其结构的难以破坏性是实现纤维素资源有效利用的最大阻碍。纤维素酶可催化水解纤维素的,糖苷键,将纤维素转化为可发酵的糖,大大提升了纤维素的可加工性和利用效率。纤维素酶广泛存在于自然界生物体内,但主要来源于微生物。目前,大多数商业纤维素酶来源于真菌,如木霉菌()、曲霉菌()和青霉菌()等,但真菌降解木质纤维素需要较长应用周期。与真菌相比,细菌具有较高的生长速率、较强的环境适应性和基因改造的韧性,因此开发产纤维素酶细菌具有很强的可行性和实用性。海洋中蕴含着丰富的微生物资源,在海洋环境中分布范围最广
4、、数量等级最高的微生物为海洋细菌。为适应独特的海洋环境,如高温、极寒、高盐、高压等,生活于其中的海洋细菌进化出各种生理机能,合成了繁多的具有新颖功效的生物活性物质。其中,所产纤维素酶往往也具有一些较好的抗性,如耐盐、耐酸碱、耐热或耐冷等性能,从中可筛选开发适用于多种条件的产纤维素酶菌株。为开发高特异性和高效的海洋微生物纤维素酶,许多国内外学者展开了大量的研究工作,如 等优化海洋细菌()发酵条件来提高纤维素酶活力,最高达 ;等对获得的海洋芽孢杆菌()进行纯化并表征得到了耐盐纤维素酶,对其做抗性研究发现在 氯化钠预培养 后仍能保持 以上的剩余活性,具备将甘蔗渣生物转化为其衍生品的能力;等对海洋假交
5、替单胞菌()进行纤维素酶功能筛选及应用工作,发现其产生的冷活性纤维素酶可有效降解海带残渣中的纤维素,将其应用于海带 应 用 海 洋 学 学 报 卷残渣的生物乙醇发酵,获得了高纯度的生物乙醇。因此,深入挖掘海洋细菌纤维素酶资源具有广阔的应用前景,并有望带来良好的经济效益。本研究以西印度洋海底表层沉积物中的细菌为研究对象,通过平板稀释涂布法分离细菌菌株,刚果红染色法筛选产纤维素酶的细菌菌株;选取透明圈直径与菌落直径比值较大且酶活性较高的菌株作为目标菌株,进行形态学、基因序列的鉴定分析,初步研究了粗酶液的性质,研究结果可为海洋细菌产纤维素酶的研究及开发利用提供一定的理论和实践参考。材料与方法 样品来
6、源本实验样品取自 年 月“向阳红”科考船西印度洋航次,利用箱式取样器采集海底沉积物,取表层 的沉积物,共 ,装入无菌袋中,保存于 冰箱中,用以后续的平板培养及分离。主要试剂及培养基细菌基因组 提取试剂盒购自上海赛百盛基因有限公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成;购自北京宝日医生物技术有限公司。蛋白胨、酵母膏、琼脂等购自上海生工生物工程有限公司;磷酸高铁、刚果红、羧甲基纤维素钠()、氯化铵、七水硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、一水合柠檬酸、,二硝基水杨酸、苯酚、酒石酸钾钠、葡萄糖、乙二胺四乙酸()等常规试剂均为国产分析纯。培养基:蛋白胨 ,酵母膏,磷酸高铁 ,陈海水 ,固体培养基另加琼脂,为
7、。筛选培养基:羧甲基纤维素钠 ,氯化铵,七水硫酸镁 ,磷酸氢二钾 ,琼脂,陈海水 ,为。发酵培养基:羧甲基纤维素钠 ,蛋白胨,酵母膏 ,磷酸高铁 ,陈海水,为。主要仪器 型号超净工作台购自苏州净化有限公司,型号全自动立式高压灭菌锅购自厦门致微仪器有限公司,生化培养箱购自宁波莱福科技有限公司,型号振荡培养箱购自上海旻泉仪器有限公司,透明圈测量仪购自杭州迅数科技有限公司,型号台式高速冷冻离心机购自德国 有限公司,多功能酶标仪购自美国 公司,徕卡显微镜 购自徕卡仪器有限公司。方法 产纤维素酶菌株初筛无菌条件下取 海泥放入装有 无菌海水的锥形瓶中,在 、条件下振荡培养 ,然后按、进行梯度稀释,分别取
8、涂布于 固体培养基上,倒置于 培养箱中培养。最终用接种环挑取不同形态的菌落在 固体培养基上划线分离纯化 次。将分离纯化获得的细菌单菌落点种至筛选培养基中,于 恒温培养箱中培养 ,至平板上有明显菌体生长。接着利用 刚果红溶液对其染色 ,再用 的氯化钠溶液进行洗脱,洗脱时间 ,该操作进行两次。然后观察菌体周围是否有透明圈出现,产生透明圈的菌株为产纤维素酶菌株。拍摄并记录透明水解圈的大小,以透明圈直径与菌落直径的比值大小来进一步筛选目标菌株。菌株复筛及酶活性测定将初筛比值较大的菌株接种于 液体培养基中,、培养 后,按照 接种于 发酵培养基中,发酵 后离心(,),所得上清液即为粗酶液,于 保存备用。纤
9、维素酶活性测定参照张盼等和 等的方法,稍作改动:在 具塞试管中加入酶液 (支平行样),再加入 的 溶液(值为 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液所配置),摇匀,于 水浴锅中反应 后取出,迅速加入 试剂,上下颠倒混匀后利用沸水浴显色 ,待冷却至室温后,加水定容至 ,轻轻上下摇匀,另取 酶液和 不含 缓冲溶液(为)作为空白,同样依上述步骤,用空白调零点,测定 波长处的吸光度。酶活力单位的定义:在上述条件下,催化 每分钟生成 还原糖所需的酶量作为 个酶活力单位。菌株鉴定 菌株形态结构及生理生化特征将目标菌株接种至 液体培养基中制成菌悬液后,经无菌水梯度稀释涂布于 固体平板上,置于 恒温培养箱中培养 ,观察细菌
10、 期吴旭东,等:西印度洋产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性初步研究 生长情况及菌落形态。生理生化特征鉴定根据伯杰氏细菌学鉴定手册和常见细菌系统鉴定手册进行。菌株分子生物学鉴定目标菌株基因组 按照细菌基因组 提取试剂盒进行提取,选择 基因的通用引物(),()进行 扩增。产物经 琼脂糖凝胶电泳检测为单一明亮条带,经胶回收后 产物送往上海生工生物工程有限公司进行测序,将测序结果上传至 数据库中进行比对分析。利用 软件中的邻接法()进行系统发育树的构建。菌株纤维素酶酶学性质研究 纤维素酶的最适反应温度及热稳定性测定最适反应温度测定:于 具塞试管中取 粗酶液和 的 溶液(为),分别于 下水浴 ,按照“”方法
11、测定酶活性,确定其最适反应温度。酶的热稳定性测定:先将粗酶液分别置于 下水浴 和 ,再按照“”方法进行酶活性反应测定,以未处理的酶液活性为对照进而计算相对酶活性,确定纤维素酶对温度的耐受性。纤维素酶的最适反应 及酸碱稳定性测定最适反应 测定:将粗酶液与不同()的 溶液混合,在最适反应温度下进行水浴,按照“”方法测定酶活性,确定其最适反应。酶的酸碱稳定性测定:先将粗酶液置于不同()的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液中,保温 和 ,再按照“”方法进行酶活性测定,其中对照组为未处理的酶液活性,确定纤维素酶对 的耐受性。金属离子和 对酶活性的影响在最适条件下,向酶反应体系中加入不同金属离子(、)及化学试剂 至其
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