蓝隐藻PC645两种β亚基的分离及空间结构差异性.pdf

第37 卷第2 期2024年4月文章编号：10 0 4-8 8 2 0(2 0 2 4)0 2-0 17 2-0 8烟台大学学报（自然科学与工程版）Journal of Yantai University(Natural Science and Engineering Edition)Vol.37 No.2Apr.2024doi:10.13951/ki.37-1213/n.221014蓝隐藻 PC6455两种亚基的分离及空间结构差异性张昆,王静，王宇涵,李琴，陈敏（烟台大学生命科学学院，山东烟台2 6 40 0 5）摘要：为了确认蓝隐藻（Chroomonasplacoidea T13）藻蓝蛋白PC645中新发现的亚基的空间结构差异性,以纯化的C.placoidea PC645为材料,经6 mol/L尿素变性后,摸索了两次DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析法，大规模分离得到了I亚基和两种2亚基洗脱样品。吸收光谱表明所得的这三种亚基洗脱组分均保持着活性状态。圆二色谱(CD)显示,I 亚基与两种2 亚基的可见光区 CD谱相近,但远紫外区和近紫外区光谱存在不同,这说明两种亚基具有相同的色基组成,但其蛋白质的二、三级空间结构存在差异,其中1亚基中-螺旋的比例高于2。上述结果不仅进一步确定了新的亚基的存在，也为重新认识特异的隐藻藻胆蛋白的亚基组成和组装方式提供了实验依据。关键词：蓝隐藻;PC645;亚基；圆二色谱;空间结构差异中图分类号：Q946文献标志码：A隐藻（cryptophytes）是一类生长在淡水和海水深层的单细胞真核浮游藻类，由蓝藻、红藻及未知物种经过二次内共生所形成,部分种属同时具有杂色植物的叶绿素（Chlorophyll,Chl）a/c-蛋白复合物与红蓝植物的藻胆蛋白 两类捕光系统，这或许代表隐藻在进化系统中位于从原始的红蓝藻类进化至杂色植物类的中间态 2-41,因此在研究光合系统进化上具有独特意义。隐藻的藻胆蛋白是藻胆蛋白家族中极为特殊的一类，也是目前发现唯一定位于类囊体膜腔的捕光色素蛋白。但是由于了解程度不及较为熟知的红蓝藻胆蛋白,对其在膜腔中的组装、分布以及如何将吸收的光能传递给膜上的Chl-蛋白复合物，从而进行光合作用的机理等尚不完全确定或存在争议。目前发现含有藻胆蛋白的隐藻每种有且仅有一种藻胆蛋白,因而不可能形成红、蓝藻中复杂的藻胆体结构。根据光谱特性,已发现的隐藻藻胆蛋白共有9种，分别为隐藻藻蓝蛋白（phycocyanin,PC）PC564、PC56 9（或PC570）、PC57 7、PC6 12、PC6 30、PC645和隐藻藻红蛋白（phycoerythrin,PE）PE545、PE555、PE56 6 5。且一般认为，它们都是由3种发光亚基组成的异二聚体（i）（2)形式存在。其中两个亚基相同,分子质量为18 2 0 kU;2个亚基不同,分别为 10.4 kU(i）)和9.2 kU(2)6.7。但实验室前期工作中发现，蓝隐藻（Chroomonasplacoidea）藻蓝蛋白PC645除了原有的亚基（i，1820 kU,等电点pI=6.2)之外,还存在一种未曾报道过的新的发光亚基,命名为2。该亚基与1亚基相比,分子质量只有16 18 kU,pI小于5.7,但目前国内外其他实验室对其尚无相关报道。为进一步确定两种亚基的存在及其差异性，本实验以自行培养的 C.placoidea 为材料,分离、纯化其藻蓝蛋白PC645,经尿素变性拆分后,通过两次阴离子交换层析,实现了对不同种类亚基的大规收稿日期：2 0 2 2-0 7-2 2基金项目：山东省自然科学基金资助项目（ZR2018LD009）。通信作者：陈敏（），教授，博士，主要研究方向为藻类色素蛋白复合物。第2 期模分离、纯化；并采用圆二色谱（circular dichroism，CD)法对所得活性亚基的二、三级空间结构进行了比对分析。1材料与方法1.1实验材料实验室自行培养的蓝隐藻（C.placoidea）,培养收集方法参照前期实验 8 1.2实验方法1.2.1PC645的分离纯化蓝隐藻PC645的分离和纯化实验条件参照文献 8。收集A645/A28o7.0的7 0%硫酸铵饱和度的PC645样品，经非变性凝胶电泳鉴定纯度后，于4避光保存备用。1.2.2PC645亚基的拆分选用PBS缓冲液（50mmol/L,pH=7)将PC645纯品浓度调至A645=13,取6 mL的PC645样品中加人2.16 g尿素（终浓度6mol/L)避光变性48 h。1.2.3?第一次阴离子交换层析采用经pH=7.5的PBS缓冲液(50 mmol/L,含6 mol/L尿素）平衡后的弱碱性阴离子交换层析剂DEAE Sepharose FastFlow对经过尿素变性的PC645样品进行层析分离，选用pH=7.5的PBS缓冲液(50 mmol/L,含6 mol/L尿素)以15 mL/h 的流速洗脱,按照洗脱曲线收集样品1与样品2,选用1 mol/L的 NaCl 以15 mL/h的流速进行洗脱，按照洗脱曲线收集样品3。1.2.4第一次等电点聚焦电泳所得样品通过超滤浓缩并除去尿素,浓度调至A645=0.8后,取50 0L样品加人10 0 L的15%三氯乙酸（TCA），混合均匀后12 0 0 0 g、4离心15min，去除上清液，用超纯水在相同离心条件下清洗沉淀并吸干水分，在沉淀中加入5L的IEF蛋白溶解液（2 5L20%Triton-X100、30 LpH310两性电解质、8 L巯基乙醇、0.5g尿素）,充分搅拌溶解后室温反应1h,上样前12 0 0 0 g、4离心10 min去除不溶物，取上清液进行后续处理。等电聚焦电泳（Isoelectricfocusing,IEF)选用7%的胶浓度，电泳条件和方法参见文献 9。电泳结束后使用相机和紫外成像仪对胶条进行拍照。1.2.5第二次阴离子交换层析将样品1和样品2分别以6 0 0 0 RCF超滤离心，浓缩至1mL后再次通过DEAESepharoseFastFlow进行层析分离，选用pH=7.5 的 PBS 缓冲液(50 mmol/L,含6 mol/L尿素)以15 mL/h 的流速洗脱1.2.6SDS-PAGE张昆，等：蓝隐藻PC645两种亚基的分离及空间结构差异性E?将二次洗脱所得组分2、3超滤173去除尿素,浓度调至A64s=0.8后,取50 0 L样品与PC645加人10 0 L的15%三氯乙酸（TCA），混合均匀后12 0 0 0 g、4离心15min，去除上清液，用超纯水在相同离心条件下清洗沉淀并吸干水分，在沉淀中加人10 L的 SDS-蛋白溶解液（0.9gSDS、0.4L巯基乙醇、1L甘油），充分搅拌溶解后37水浴加热2 h,上样前12 0 0 0 g、4离心10 min去除不溶物，取上清液进行后续处理。浓缩胶浓度选用7%，分离胶浓度选用14%，电泳条件和方法参见文献 9。电泳结束后于紫外灯下拍照。将胶板于10 0 mL考马斯染色液（0.0 2 g考马斯亮蓝G250,40mL甲醇,7.5mL冰乙酸）中染色6 h，于脱色液(0.5mol/L NaCl)中侵泡震荡,脱色过夜后于自然光下再次拍照。1.2.7第二次IEF电泳将二次洗脱所得组分2、3超滤去除尿素。取2 0 0 L样品加人40 L的15%TCA,处理方法同第一次IEF电泳。1.2.8吸收光谱分析以 PBS缓冲液(50 mmol/L,pH=7)溶解的藻蓝蛋白样品（A645=15）为参比;将拆分后的亚基样品使用 PBS 缓冲液(50 mmol/L,pH=7.5,含4mol/L尿素）调整浓度至A360=0.5左右,采用TU-1900紫外-可见分光光度计（北京谱析通用）测定其吸收光谱。1.2.9CD光谱测定将PC645各亚基样品A64s调至0.4,使用J-810圆二色谱仪（日本JASCO)对各样品进行全波段（190 7 50 nm)扫描，比色皿光径0.1cm,以超纯水为参比进行基线校正。2结果与分析2.1第一次DEAE离子交换层析6mol/L尿素变性后的7 0%PC645样品进行第一次DEAE离子交换层析效果如图1所示。231(a)PBS 缓冲液洗脱(b)NaCI溶液洗脱图1第一次DEAE离子交换层析Fig.1 The first step of DEAE ion exchange chromatography174由图1可见,PBS缓冲液洗脱得到样品1和样品2,样品1的前沿含有绿色组分，样品2 为蓝色。NaCl溶液洗脱得到的样品3颜色与样品2 相近，但较样品2 更深。根据A28o绘制的洗脱曲线如图2。当以PBS缓冲液洗脱时,洗脱曲线于11mL和19mL处依次出现两个洗脱峰,分别对应样品1与样品2。其中偏碱性的PC645亚基在pH=7.5时带正电荷,因无法与DEAE阴离子交换剂相结合,故在淋洗过程中最先被洗脱下来;且因亚基只含有中胆绿素(me-sobiliverdin,MBV)色基，其最大吸收波长可长达6 97nm因而呈绿色。由于亚基偏酸性,在pH=7.5时带负电荷,因此推测样品2 为含亚基的组分，与阴离子交换剂存在结合但结合不够牢固,因此洗脱顺序次于样品1先于样品3。当PBS缓冲液洗脱体积达到30 mL时，无组分被淋洗下来后，再以NaCl溶液进行洗脱,仅在洗脱体积9 mL出现一个洗脱峰，对应样品3，此样品同阴离子交换剂结合最为牢固,且同样为蓝色,推测样品3为比样品2 中亚基含量更高的组分。烟台大学学报（自然科学与工程版）但仍沾染有少量其他亚基成分。带2 和3的电泳结果类似,除了之外,含有相对含量更高的亚基,并形成了一系列等电点不同的蓝色的条带,这说明样品2 和样品3为含有不同比例的1和亚基的洗脱成分。14242(a)自然光下第37 卷232+2+2(b)紫外灯下3.pH1033.532.521.510.50-PBS洗脱曲线-NaCl洗脱曲线样品3样品1样品251015202530洗脱体积/mL图3第一次DEAE离子交换层析所得样品的变性IEF电泳结果Fig.3Denatured IEF electrophoresis profiles of the samplesobtained by the first step of DEAE ion exchange chro-matography2.3第二次DEAE离子交换层析将样品1和样品2 以6 0 0 0 RCF超滤离心后，分别进行第二次层析分离，使用PBS缓冲液的洗脱过程如图4所示。图2 第一次DEAE离子交换层析洗脱曲线2Fig.2The first DEAE ion exchange chromatography elutioncurve2.2第一次IEF电泳对第一次DEAE离子交换层析洗脱所得的样品1、2、3,分别进行IEF电泳,在自然光(图3（a)）和紫外光（图3（b)）下观察结果显示,样品1在pH=8.3和pH=7.0处可存在含量较低的绿色条带（紫外灯下呈暗红色荧光,分别对应和亚基 ;此外还观察到一个主要的蓝色条带（紫外灯下呈粉白色荧光,pI=6.2）,对应于l;而对应于亚基（蓝色,pl=5.7)处的条带含量明显较少,且在酸性区没有更多的蓝色条带出现。说明带1中富含亚基，(a)样品 1图4第二次DEAE离子交换层析Fig.4The second step of DEAE ion exchange chromatography结合图5洗脱曲线可知，样品1和样品2 的洗2(b)样品 2 第2 期脱曲线中均存在两个洗脱峰，与洗脱组分数量一致；样品1分别于11mL(组分1,图4(a)绿色带）和16mL(组分2,图4(a)蓝色带)产生洗脱峰,且绿色的组分1的洗脱峰面积明显大于蓝色组分2。这说明样品1中主要成分为先被洗脱下来的组分1，该组分应为未与阴离子交换剂结合的亚基；而蓝色的组分2,应为等电点偏中性的1亚基。样品2 则分别在16 mL(组分3,图4(b）下方条带）和19mL（组分4，图4（b）上方条带）处出现洗脱峰，相比组分3，组分4洗脱峰面积更大，含量更高,推测二者均为等电点较低的2亚基相关洗脱组分,分别称作和2。1.671.41.21-0.80.60.40.20图5第二次DEAE离子交换层析洗脱曲线Fig.5 The second DEAE ion exchange chromatography elutioncurve2.4SDS-PAGE与IEF电泳验证将第二次DEAE离子交换层析后所得的组分2、组分3、组分4及PC645分别进行SDS-PAGE与张昆，等：蓝隐藻PC645两种亚基的分离及空间结构差异性一样品1-样品2组分4组分1组分2组分351015202530洗脱体积/mL175IEF电泳分析。可以看出组分2 及组分3在SDS-PAGE（图6（a)）和IEF中（图6（b)）均只呈现单一条带,分别对应PC645中的1、2 亚基。IEF结果还显示,在碱性区,组分2、3、4均不再出现亚基条带，紫外光下无明显的亚基荧光带（图6（c）。由于紫外灯下的荧光较可见光下观察更灵敏因而说明组分2、组分3和组分4都剔除了亚基。组分2 中只在pH=6.2处出现明显的对应l亚基的荧光条带,说明该组分应为纯化的1亚基；而组分3在pH=5.7处的荧光条带则对应于2亚基,说明该组分应为纯度较高的亚基（图6（c)）。组分4的IEF结果中基本看不到1亚基条带,但除了pH=5.7处2亚基组分外,还形成了多个等电点小于5.5的荧光带,这一现象在其他隐藻藻胆蛋白中也有发现 5,值得今后进一步探讨。2.5拆分后的亚基吸收光谱吸收光谱（图7)显示,除了紫外区2 8 0 nm蛋白吸收峰外，组分2、3、4在近紫外区均存在359 36 3nm主峰和40 3nm肩峰,且峰形相近,说明其色基成分基本相同。但组分2(亚基)主峰在359nm,较富含亚基的组分3、4短3nm左右,这说明分离后的两种亚基的色基所处的蛋白质微环境稍有差别。可见光区50 0 7 0 0 nm跨度内,均只存在609 nm一个吸收主峰,应该是亚基上的二氢胆绿素（15,16-dihydrobiliverdin,DBV,最大吸收58 0 nm）和藻蓝胆素（phycocyanobilin，PCB，最大吸收6 45nm)色基叠加的结果。上述结果说明,组分2、3、4均呈现活性亚基的光谱形态,为后续CD谱测定及空间结构比较奠定了基础。PC645 2 3 pH10PC645组分2组分3234pH102B2243(a)SDS-PAGE(b)可见光下IEF电泳结果图6 PC645及第二次DEAE离子交换层析后的各组分的电泳结果Fig.6 Electrophoresis profiles of PC645 and the fractions after second step of DEAE ion exchange chromatography3(c）紫外光下IEF电泳结果176图7 第二次DEAE层析后各组分吸收光谱Fig.7The absorption spectra of factions after second step ofDEAE chromatography2.6两种亚基的圆二色谱由于，亚基在其他实验室未曾报道,因此实验在纯化得到的两种活性亚基组分后,首次提供了其不同波谱区段的圆二色谱测定结果。2.6.1远紫外区远紫外区（190 2 50 nm）的信号是由肽键的电子跃迁产生的，可以反映蛋白质多肽的肽骨架结构（二级结构）信息。-螺旋在 191nm处有1个正峰,在2 0 7 2 10 nm和2 2 1 2 2 2 nm处有2 个负峰;-折叠在195 197 nm处有1个正峰,在2 17 2 18 nm处有1个负峰;-转角在2 0 5nm处有1个正峰，在2 2 0 2 30 nm处有1个弱信号负峰,在18 0 190 nm处有1个强信号负峰;而无规卷曲在2 12 nm处有1个正峰,在2 0 0 nm处有1个负峰(0。远紫外区CD谱（图8）显示，亚基主要在220 nm处有一个大的负峰,是由-螺旋产生,但已没有明显的“W型”，在191nm处-螺旋的极值波长处依稀可见,但噪声较大;2、2 洗脱组分的CD谱相似,但与信号峰相比明显不同,原有的W型负峰，只保留了2 10 2 13nm负单峰；190 192 nm附近的正峰大幅度降低，同时新产生了一个2 0 2 207nm正峰和195 199nm的一个负峰。上述结果说明,2 种拆分后的亚基表现出了二级结构的差异,其中,亚中-螺旋的比例应高于2;而 2亚基中-折叠的比例似乎高于1。2.6.2?近紫外区近紫外区(2 50 340 nm)的CD谱可用来分析PC645三级结构的精细变化。当色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）和二硫键处于不对称的微环境时,在近紫外区会表现出CD信号。拆分后亚基的近紫外区（图9）CD谱总烟台大学学报（自然科学与工程版）体相似,但细节不同。由于两种亚基的等电点不13620.83592800.60.40.20300第37 卷同，说明其亚基蛋白的表面电荷或者说氨基酸分布2P2.4036094005002/nm存在差异。CD谱中三者都出现了2 592 6 0 nm、271278nm和2 8 3 2 8 6 nm的正峰，只是的260nm正峰为主峰,而,和z为肩峰。主要的差异在于亚基有一个30 1 nm 的正的肩峰,而两个亚基都没有;两个亚基于335nm处均存在一个正的肩峰,亚基中则不存在。由于蛋白质三级600700结构的复杂性,使 CD谱的详细解析较为困难,因此通常只能给出趋势性的结论,即和亚基在三级结构上可能存在细节性的差异。202620720042191.195Bapu/ao0-2192-4-6-8-10-12180 190 200 210图8 亚基(A64s=0.4)在远紫外区的圆二色谱Fig.8 The CD spectra at far ultraviolet region of subunits(A645=0.4)1-0.53opu/a0-0.5-1-1.5-2240260280300320 3403602/nm图9亚基(A645=0.4)在近紫外区的圆二色谱Fig.9The CD spectra at near ultraviolet region of subunits(A 645s=0.4)2.6.3可见光区可见光区（340 7 50 nm）的信号峰通常与吸收光谱的吸收峰相对应,是由蛋白质辅基等外在发色团造成-15。可见光区的图谱（图10)显示3个样品的CD谱趋势大致相同,拆分后两种亚基主要存在4个明显的信号区,分别是P2P22301992131962102200220230240250260/nm272.28426030131231733522第2 期可能与四吡咯色基有关的36 0 36 6 nm负峰和450456 n m 的负峰（对应其吸收光谱近紫外区32 0 450 nm的主峰）;其次是与亚基DBV色基（50/61）相关的58 0 595nm的正峰和与2 个PCB（158 和82)色基有关的6 0 0 6 2 0 nm以及6 44645nm的正峰（对应于其吸收光谱可见光区6 0 9nm处叠加后的主峰）。上述结果进一步说明，和2亚基所结合的色基种类和数量应不存在质的差别。1.510.5Bopu/ao0-0.51-1-1.5-2300图10 亚基(A64s=0.4)的可见光区圆二色谱Fig.10 The CD spectra at visible range of subunits(A64s=0.4)3结果与讨论由于隐藻是由红藻经过二次内共生的进化产物,因此藻体细胞存在四个基因分布中心,即隐藻细胞核、线粒体、红藻残核（类核体以及红藻质体,且彼此之间存在一系列复杂的基因转移 16-17 。目前认为,隐藻亚基是由一组小的核基因家族编码，而亚基则是由叶绿体基因编码 18-19,但编码亚基的基因数量在不同的种属各不相同。尽管目前已报到的隐藻藻胆蛋白的亚基大都只有一个编码基因，但实验室前期工作采用双向电泳方法分离变性拆分后的藻胆蛋白亚基 6.0 ,显示蓝隐藻PC645除了原有的亚基之外,很可能还存在一种分子质量更小、等电点更偏于酸性的2亚基。但由于电泳方法分离量小,且电泳过程本身还可能对蛋白造成破坏而产生假带,得到的亚基条带洗脱后通常蛋白空间结果极易发生改变,难于保持活性的状态,因而对新的发光亚基的存在和特性有待进一步确定和分析。由于隐藻异二聚体结构非常稳定,在pH 310 范围内均可保持不解离 2 1,因此亚基拆分困难;两个亚基之间的分子质量只相差不到2 kU，借助分子质量差异分离这两种亚基也存在相当的难度 2 0 。实验摸索了高浓度尿素变性后两次DEAE张昆，等：蓝隐藻PC645两种亚基的分离及空间结构差异性595-2645530700455357400177阴离子交换层析分离方法和条件,利用两种亚基表面电荷差异（两个亚基等电点pI存在约0.5个pH单位的差别,1为6.2;2为5.7）,实现了亚基的大规模分离。经IEF检测,得到的3种亚基组分不含亚基,（组分2)和2（组分2)基本得到了纯化。2（组分4）富含亚基,但离子交换洗脱体积更大，等电点更低（pI低于5.5）,有待进一步分析。吸收光谱显示,所得各亚基洗脱组分均保持着活性状态,为今后亚基的氨基酸序列分析及空间结构解析等奠定了基础。2圆二色谱常用于蛋白质结构研究,能够反映蛋白质不同层次的构象特性,亦能监测分子构象变化的过程，且灵敏度优越于可见与紫外吸收光谱。实验对纯化后的各不同亚基洗脱组分进行了不同波谱区域的圆二色谱分析比对。结果表明,与500600/nm7008002、2 3个样品的可见光区CD谱峰形相同,说明亚基所含色基类型基本一致。但远紫外区CD谱显示亚基与2及z组分的信号峰差别较大,为两种完全不同的类型,且近紫外区 CD谱也略有不同,说明两种亚基不仅分子质量和等电点不同,且在二级结构以及三级结构上也存在差异。组分3和4中的主要成分均为2亚基,其余成分可能略有所不同,但CD谱只在峰值或峰位存在细微差别,但光谱峰形特征相同。因此 CD谱结果不仅可确定两类亚基的空间结构差异性，今后还可作为两类亚基分型的指标。由于两个亚基可能源自同一个基因,且该基因没有内含子存在 2 2 ,因此也不是转录后的拼接过程造成的不同,其分子质量、等电点以及空间结构差异是源于翻译后氨基酸修饰或其它未知原因引发有待于进一步分析。实验结果进一步确定了藻蓝蛋白PC645 新的亚基的存在,且提供了其CD谱特性和空间结构差异性分析结果，因而目前公认的i2il 将不再是唯一的隐藻藻胆蛋白异二聚体形式,该结论打破了原有的对隐藻藻胆蛋白亚基组成和组装方式的认识，为重新认识隐藻特异的藻胆蛋白结构及功能提供了依据。参考文献：1 HOEF-EMDEN K,MELKONIAN M.Revision of the ge-nus Cryptomonas(Cryptophyceae):a combination of molecularphylogeny and morphology provides insights into a long-hiddendimorphismJ.Protist,2003,154(3-4):371-409.2G RZEBY K D,SCH O FIEL D O,VET RIA NI C,e t a l.T h e178Mesozoic radiation of eukaryotic algae:the portable plastid hy-pothesis1J.Journal of Phycology,2003,39(2):259-267.3BOLTE K,KAWACH O,PRECHTL J,et al.Comple-mentation of a phycocyanin-bilin lyase from Synechocystis sp.PCC 6803 with a nucleomorph-encoded open reading frame fromthe cryptophyte Guillardia theta J.BMC Plant Biology,2008,8:56.4】G REENWO L D M J,CU NNING H A M B R,L A CH ENM Y-ER E M,et al.Diversification of light capture ability was ac-companied by the evolution of phycobiliproteins in cryptophytealgae 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Life Sciences,Yantai University,Yantai 264005,China)Abstract:In order to identify the spatial structure diversity of a new subunit found in phycocyanin PC645 ofChroomonas placoidea T13,a large-scale of separation procedure of two steps of DEAE sepharose fast flow anion ex-change chromatography is established and by which a i subunit and two 2 subunits components are eluted after 6mol/L urea denaturation of purified PC645 from self-cultured C.placoidea.The absorption spectra results confirmthat the three subunits elutes are all remained in active state.The circular dichroism(CD)shows that the isubunit exhibits similar CD features in visible region to the two 2 subunits,but varies both in the far and near ul-traviolet region.This result indicates that the two types of subunits have the same bilin composition,but the sec-ondary and tertiary spatial structure of proteins are different.The i subunit possesses higher proportion of helixthan that of 2.The results above not only furtherly confirm the existence of new subunit,but also provide a di-rect experimental basis for re-understanding of the subunit composition and assembly of the specific cryptophytic bil-iproteins.Keywords:Chroomonas placoidea;PC645;subunit;circular dichroism;spatial structure diversity(责任编辑周雪莹）