大蒜、青菜等蔬菜作物对根际微生物的影响.pdf
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1、科学版),2 0 2 4,45(1):50-58.引文格式:徐浴力,周昕,陈学好菜作物对根际微生物的影响J:扬州大学学报(农业与生命Jan.2024Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2024年1月Vol.45 No.1第45卷第1期扬州大学学报(农业与生命科学版)DOI:10.16872/ki.1671-4652.2024.01.007大蒜、青菜等蔬菜作物对根际微生物的影响徐浴力,周昕,陈学好,徐强*(扬州大学园艺园林学院,江苏扬州2 2 50 0 9)摘要:大蒜和青菜是重要的蔬菜作物,对土
2、壤微生物群落有着不同的影响。通过IlluminaMiSeq测序技术,研究大蒜、青菜等不同蔬菜作物对根际微生物的影响。结果表明:Q(株行距0.1m0.3m,种植青菜)处理土壤细菌群落的多样性和丰度增加,S(株行距0.1mX0.3m,种植大蒜)和SC(株行距0.2 mX0.3m,种植大蒜)处理土壤细菌群落多样性和丰度减小;S和SC处理对细菌多样性的影响高于Q处理;芽单胞菌属(Gemmatimonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)为S、SC 处理共有的优势菌属,相对丰度显著高于Q处理和CK;芽单胞菌属与Saccharibacteria、Ra m lib a c t e r 等菌属呈正相关,与黄色
3、类固醇杆菌属(Steroidobacter)、JT B2 55等菌属呈负相关,对细菌群落构成有重要影响,降低大蒜种植密度可降低芽单胞菌属的相对丰度,合理的大蒜种植密度可起到改善细菌群落结构的作用。综上,该研究对进一步了解蔬菜作物根系微生物群落的作用、活动调控机制以及土传病害与连作障碍的关系具有重要意义。关键词:大蒜;青菜;根际土壤;Illumina高通量测序;细菌群落;芽单胞菌中图分类号:S633文献标志码:A文章编号:16 7 1-46 52(2 0 2 4)0 1-0 0 50-0 9Effects of different cultivated crops of garlic andgr
4、een vegetable on rhizosphere microorganismsXU Yuli,ZHOU Xin,CHEN Xuehao,XU Qiang(College of Horticulture and Landscape Architecture,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)ABSTRACT:Garlic and green vegetable are important horticultural crops with different effects on soil microbial communi-ties.In
5、 this study,Ilumina MiSeq sequencing technology was used to further investigate the effects of different cultivatedcrops,such as garlic and cabbage,on rhizosphere microorganisms.Results showed that the Q(green vegetable were colo-nized at 0.1 mXo.3 m)treatment increases the diversity and abundence o
6、f soil microbial communities,S(garlic were col-onized at 0.1 m X 0.3 m)and SC(garlic were colonized at 0.2 mX0.3 m)tended to reduce soil bacteria community diver-sity;The effect of S and SC treatment on bacteria-diversity is higher than Q;Gemmatimonas and Bacillus were thedominant genera shared by S
7、 and SC,and their relative abundance was significantly higher than that of Q and CK.Gem-matimonas and Saccharibacteria,Ramlibacter bacteria were positively correlated,and Steroidobacter,JTB255 speciesshowed a negative correlation,and had important effects on bacterial community composition.Reducing
8、the garlic plant-ing density can reduce the relative abundance of bacterium,reasonable garlic planting density can play a role in improvingbacterial community structure.To further explore the effects of plant root microbial community,regulation and controlmechanism and the soil borne disease activit
9、y and the relationship between the continuous cropping obstacle has the vitalsignificance.KEY WORDS:garlic;green vegetable;rhizosphere soil;Illumina high-throughput sequencing;microbial community;Gemmatimonas大蒜(Allium satiuumL.)是世界上广泛栽培的一种蔬菜,也是一种广泛使用的草药。大蒜富含收稿日期:2 0 2 3-0 5-2 1基金项目:江苏现代农业产业技术体系建设专项J
10、ATS(2 0 2 1)49 4、JA T S(2 0 2 2)49 4、JA T S(2 0 2 3)451;江苏省苏北科技专项(SZ-H A 2 0 2 10 32);扬州市现代农业项目(Y72020036)作者简介:徐浴力(19 9 8 一),男,江苏张家港人,扬州大学硕士研究生,主要从事蔬菜土壤连作障碍研究。*通信作者,徐强,扬州大学教授、硕导,主要从事设施蔬菜育种与栽培研究;E-mail:x u q i a n g y z u.e d u.c n。51徐浴力等等蔬菜作物对根际微生物的影响第1期生素和矿物质,具有杀虫抗菌以及抗氧化、预防心脑血管疾病等功效1。大蒜的抗菌、抗病毒和抗氧化等
11、生物和非生物环境胁迫能力以及吸收重金属潜力,可用于土壤污染修复,但大蒜的抗菌作用,可能会抑制土壤微生物群落的丰富度和多样性2)。青菜(Brassica chinensisL.)是江浙沪地区广泛栽培的重要蔬菜,在江苏青菜广泛种植。研究其根际土壤细菌群落的多样性,对选取冬茬蔬菜进行合理轮作具有重要的意义。土壤和植物通过植物根际相互作用,根际微生物易受植物和外界环境因素的影响,对植物的生长发育起着关键作用3。在植物生长过程中,根系不断产生分泌物,影响根系周围环境的同时还引起细菌、真菌和放线菌等微生物繁殖4。微生物通过自身酶分解根系分泌物及土壤中有机质,加快土壤养分转化,改善土壤理化性质,促进植物生长
12、。微生物对维持土壤稳定性有着重要作用,作物连作障碍原因之一就是微生物群落失衡5。此外,土传病害的感病和抗病植物,其根际微生物群落有着明显差异,说明土传病害与根际微生物存在一定的关系6 。传统测定微生物方法有微生物平板计数法、PLFA生物标记法、Biolog微孔板法等,由于限制因素较多,传统方法很难详细描述微生物群落结构及组成差异。而IlluminaMiseq16SrRNA高通量测序则可克服传统方法操作复杂、误差较大和通量低等缺点,还具有低成本、高准确性和操作简单等特点,可同时对多个样本的可变区进行测序,进一步提高测序通量和测序速度,广泛用于微生物群落多样性的研究7。本研究通过Illumina高
13、通量测序技术,分析设施大棚中大蒜、青菜等不同蔬菜作物对根际土壤微生物群落的影响,探究不同蔬菜作物中关键菌群对群落构成的影响,旨在为了解植物根系微生物群落的作用、活动调控机制以及土传病害与连作障碍的关系提供理论基础,为蔬菜绿色高产提供技术指导。1材料与方法1.1试验地概况试验于2 0 2 0 一2 0 2 1年在扬州大学园艺园林学院试验基地(32 2 3N、119 2 5 E)进行。试验基地属亚热带湿润季风气候,年平均气温14.8,年平均日照数2 17 2.3h。土壤理化性质:pH值6.8,有机质2 2.55gkg-1,碱解氮114.2 5mgkg-1,速效磷48.46 mgkg-1,速效钾7
14、3.2 5mgkg-11.2供试材料选取太仓白蒜、扬州青作为试验蔬菜品种,种植于大棚内,新冠疫情期间大棚休耕6 个月,无种植前茬作物。试验设4个处理:S处理,株行距0.1mX0.3m,种植大蒜;SC处理,株行距0.2 m0.3m,种植大蒜:Q处理,株行距0.1mX0.3m,种植青菜。以不种植任何蔬菜为对照(CK)。试验随机区组设计,3次重复,小区面积15m,大棚两头设保护区。上述处理均在相同水肥条件下进行,采用常规方式进行栽培管理。1.3试验方法1.3.1土壤取样于2 0 2 1年2 月2 6 日采集大蒜和青菜根际土壤样品,此时大蒜和青菜已处于成熟期。S、SC 和Q处理各取10 株健壮植株,采
15、用抖根法8 1抖去根附近大块土壤,收集根表面小块土壤混合为一份样品,剔除杂质后装人灭菌自封袋中。CK样品采用随机取样法采集10 处CK小区地下10 cm处土壤样品,混匀后装人灭菌自封袋中。自封袋置于一8 0 超低温冰箱中冷冻待测。1.3.2土壤DNA提取采用MagPureSoilDNALQKit抽提试剂盒(美国Magen公司)提取不同处理土壤样品的基因组DNA,每个样品6 个重复,而后利用10 gL-1琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000试剂盒(美国ThermoFisher公司)检测DNA浓度。1.3.3细菌16 SrRNA扩增、IlluminaMiseq测序以提取的土壤样品基因组DNA为
16、模板,选择V3-V4可变区前端引物343F(5-T A CG G RA G G CA GCAG-3)和后端引物7 9 8 R(5-A G G G T A T CT A A T CCT-3)(表1)进行PCR扩增,电泳检测后使用磁珠纯化,纯化产物作为二轮PCR模板,并进行二轮PCR扩增,再次电泳检测后使用磁珠纯化,纯化后PCR产物以Qubit定量。根据PCR产物浓度采用等量混样,并在IluminaMiSeqPE250测序平台上测序(上海欧易生物医学科技公司)。52第45卷扬州大学学报(农业与生命科学版)1.4数据处理原始数据为FASTQ格式。使用Trimmomatic软件对原始双端序列去杂,并通
17、过滑窗法检查平均碱基质量,用FLASH将已去杂的双端序列拼接。为保证结果的准确性,对序列进行精准去杂,去除含模糊碱基、含单碱基高重复区序列和长度过短序列。精准去杂参数如下:删除包含N碱基的序列,保留碱基质量分数(Q20)75%的序列。利用UCHIME删除序列中的嵌合体序列。将测序数据预处理后得到优质序列,使用Vsearch软件将相似的序列进行OTU分析。序列相似度9 7%的归类为1个OTU单元。通过QIIME软件筛选OTU的代表序列,将其与Silva(v e r s i o n 132)数据库比对并注释,使用RDPclassifier软件进行注释,保留置信区间 0.7 的注释结果9 1.5数据
18、分析多样性分析:采用KruskalWallis/Wilcoxon等算法计算不同多样性指数在不同分组的差异显著性,并评估样品内物种丰富度和分布均匀度;多样性分析:基于BrayCurtis距离矩阵算法的PCoA,评估不同分组的群落分布差异显著性;土壤细菌相关性分析:计算不同样本相对丰度的spearman相关系数,构建物种相互作用网络;KEGG(K y o t o En c y c l o p e d i a o f G e n e s a n d G e n o me s)功能分析:通过KEGG在不同水平的结果结合Kruskal-Wallis算法统计差异,对差异结果进行heatmap图分析;数据统
19、计分析:通过SPSS26.0软件并结合Duncans分析法进行数据比较。2结果与分析2.1不同蔬菜根际土壤细菌群落多样性分析2.1.1土壤细菌群落多样性分析对4个土壤样品的原始总序列进行质控过滤和优化,得到4个处理平均有效序列数分别为6 8 39 0、69352、6 2 6 9 0 和6 19 45条(表1)。由表1可见,土壤样品覆盖率为9 8.6 2%9 8.8 4%,说明各处理土壤样品文库覆盖的细菌类群达到9 8.6 2%以上,可真实地反映各处理土壤样品的细菌群落结构组成及分布特征。各处理物种数、香农指数、辛普森指数以Q处理最高,依次高于CK和SC、S处理,说明Q处理有利于提高根际土壤细菌
20、群落的多样性,S处理有利于减少有害细菌群落的多样性,而SC处理多样性升高则表明降低大蒜种植密度在一定程度上可改善细菌群落。表17不同蔬菜根际土壤细菌多样性指数Tab.1Diversity index of bacterial in rhizosphere soil of different vegetables处理有效序列物种数香农指数辛普森指数Chaol 指数覆盖率/%treatmentvalid sequenceobserved speciesShannon indexSimpson indexChaol indexratio of coverageS683902.551293h8.820
21、.34b0.99280.0019b3228.87310.13b98.840.0010aSC693522969318a9.250.39a0.995 20.001 7a3798.34344.53a98.620.00125Q626903248315a9.600.30a0.99600.0009a3874.05298.53a98.74 0.000 9abCK619453227213a9.480.11a0.99560.0019a3882.59238.74a98.650.001.3b*同列不同小写字母数值间差异显著(P0.05)。*D if f e r e n t lo w e r c a s e le t
22、 t e r s b e t w e e n t h e s a m e c o lu m n in d ic a t esignificantdifferences(P 5.50%为优势菌门,在各处理中,变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门和厚壁菌门为大蒜和青菜根际土壤的优势菌门,其中变形菌门相对丰度高达40.9 4%49.0 7%,拟杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门和厚壁菌门相对丰度分别为10.6 3%17.7 2%、11.6 8%14.30%、9.18%16.7 3%和5.6 1%8.27%。在这些优势菌门中,S和SC处理土壤变形菌门的相对丰度低于Q处理和CK,且S、SC处理100oth
23、ersFusobacteria80Dependentiae%/丰赵Nitrospirae60PatescibacteriaAcidobacteriaFirmicutes40GemmatimonadetesActinobacteria20BacteroidetesProteobacteria0SSCQCK处理 trcatmcnts2(001.胖)8 10册鲁册册SSC-1QCK2ProteobacteriaGemmatimonadetesAcidobacteriaNitrospiraeFusobacteriaBacteroidetesFirmicutesPatescibacteriaDepend
24、entiaeVerrucomicrobia门 Phylum图3门水平上不同蔬菜根际土壤主要优势细菌及其相对丰度Fig.3Main dominant bacteria and their relative abundance in rhizosphere soil of different vegetables at phylum level54扬州大学生命科学版)第45卷与Q处理、CK差异显著;S、SC和Q处理土壤拟杆菌门相对丰度低于CK,且SC、S处理与CK差异显著;CK、Q 处理与S处理土壤放线菌门相对丰度低于SC处理,但各处理差异不显著;S和SC处理土壤芽单胞菌门相对丰度高于Q处理和CK
25、,且S、SC处理与Q处理、CK差异显著;SC处理厚壁菌门相对丰度显著高于S处理。这表明种植大蒜可显著降低变形菌门、拟杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度,同时降低大蒜种植密度可显著提高厚壁菌门的相对丰度。2.2.3土壤细菌属水平相对丰度分析由图4可知,在土壤细菌属水平上,不同处理土壤优势菌属群落差异明显。其中CK土壤优势菌属分别为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas,相对丰度3.59%,下同)、黄色类固醇杆菌属(Steroidobacter,2.66%)、M ND 1(2.51%)、东属(Dongia,2.0 9%)、黄杆菌属(Flavobacterium,1.58%)、类芽孢杆菌属(Paenib
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