青蒿素-丙酮层共组装纳米药制备、表征及体外抗肿瘤初步评价.pdf
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1、学学报(农业上命科学版):2024.45(1):8 4-9 2.昊,等青蒿素-丙酮层共组装纳米药制备、表征及体外抗肿瘤初步评价J。扬州大引文格式:李宛俞,徐湘迪,薛Jan.2024Journal of Yangzhou University(Agricultural and Life Science Edition)2024.年月Vol.45 No.1扬州大学学生命科学版)第45卷第1期DOl:10.16872/ki.1671-4652.2024.01.011青蒿素-丙酮层共组装纳米药制备、表征及体外抗肿瘤初步评价李宛俞,徐湘迪,薛昊”,金旭东,许金晶,陈靖13*(1.扬州大学医学院(转化医学
2、研究院),江苏扬州2 2 50 0 9;2.深圳大学医学部生物医学工程学院,广东深圳518 0 6 0;3.扬州大学江苏省中西医结合老年病防治重点实验室,江苏扬州2 2 50 0 9)摘要:为解决青蒿素及其丙酮层(以多甲氧基黄酮为主成分的青蒿素工业提取废料)的水溶性差导致其抗肿瘤应用受限的问题,采用乳化-溶液挥发法,构建质量均一、结构稳定的青蒿素-丙酮层超分子共组装纳米药。应用激光粒度仪、傅里叶变换红外光谱仪及扫描电子显微镜等对其进行表征,并以MTT、划痕试验测定纳米药对小鼠源CT26结肠癌细胞增殖、迁移能力的影响。结果表明:所制备的纳米药平均粒径10 6.93nm,载药量7.7 8%,包封率
3、7 2%;MTT试验检测共组装药物(青蒿素、丙酮层量之比1:2)ICso为青蒿素、丙酮层浓度比17.13mgL-1:34.2 7 m g L-1,显著优于各药单用组;划痕试验表明共组装药物对肿瘤细胞迁移具有显著抑制作用。综上,制备的青蒿素-丙酮层超分子共组装纳米药具有较强抗肿瘤活性,为抗肿瘤药物开发和中药提取废弃物循环利用奠定了重要基础。关键词:青蒿素;丙酮层;共组装;纳米药;抗肿瘤中图分类号:S853.7;R 2 8 5文献标志码:A文章编号:16 7 1-46 52(2 0 2 4)0 1-0 0 8 4-0 9Preparation,characterization and prelim
4、inary in vitro antitumor evaluationof artemisinin-acetone layer co-assembled nanomedicinesLI Wanyu,XU Xiangdi,XUE Hao”,JIN Xudong,XU Jinjing,CHEN Jingl-?(1.College of Medicine(Institute of Translational Medicine),Yangzhou University,Yangzhou 225009,China;2.School of Biomedical Engineering,Health Sci
5、ence Center,Shenzhen University,Shenzhen 518060,China;3.Jiangsu Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention andTreatment of Senile Diseases,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China)ABSTRACT:To solve the problem of poor water solubility of artemisinin and its
6、 acetone layer(industrial extraction wasteof artemisinin with polymethoxyflavonoids as the main component)which leads to the limitation of its antitumor applica-tion,the supramolecular co-assembled nanomedicine of artemisinin and acetone layer with homogeneous quality and stablestructure was constru
7、cted by using the method of emulsification-solution volatilisation.Laser particle size apparatus,fou-rier transform infrared spectrometer and scanning electron microscope were applied to characterize them,and MTT andscratch assay were used to determine the effects of nanomedicines on the proliferati
8、on and migration ability of mouse-de-rived CT26 colon cancer cells.The results showed that the average particle size of the prepared nanomedicine was106.93 nm,the drug loading capacity was 7.78%,and the encapsulation rate was 72%;the IC50 of the co-assembleddrug(artemisinin:acetone layer=1:2)was art
9、emisinin:acetone layer=17.13 mg L-1:34.27 mg L-1,which wassignificantly better than that of the single-use group of the drugs,and the scratching experiment demonstrated that the co-assembled drug had a significant inhibition effect on the migration of the tumor cells.In conclusion,the supramolecular
10、co-assembled nanomedicine of artemisinin-acetone layer prepared in this study has strong anti-tumor activity,which lays animportant foundation for the development of anti-tumor drugs and the recycling of traditional Chinese medicine extract waste.KEY WORDS:artemisinin;acetone layer;co-assembly;nanop
11、harmaceutical;antitumor收稿日期:2 0 2 3-0 8-13基金项目:国家自然科学基金资助项目(8 17 6 0 37 7);扬州大学大学生学术科技创新基金项目(X20220754)作者简介:李宛俞(2 0 0 2 一),女,江苏徐州人,扬州大学学生、主要从事纳米给药系统研究。*通信作者,陈靖,扬州大学教授、博导,主要从事中药提取废弃物循环再利用研究;E-mail:c h e n j i n g 2 0 18 y z u.e d u.c n。烷85李宛俞等:青蒿素-丙酮层共组装纳米药制备表征及体外抗肿瘤初步评价第1期疾是经按蚊叮咬或输人带疮原虫者的血液而感染症原虫所引起
12、的虫媒传染病,是严重威胁人类生命安全的寄生虫病1-2 。青蒿素(artemisinin,A R T)是继传统抗疟药之后出现的最高效的一线抗症药,尤其对脑型疟疾和对氯喹耐药的疾具有速效低毒的特征。除具有显著的抗疟活性,青蒿素还能通过抑制癌细胞增殖、诱导细胞调亡等多重机制发挥抗肿瘤作用。近年来,国内外科研人员3 成功合成多种以青蒿素为主的纳米载体,这些均显示出优异的抗肿瘤效能。Liu等4 利用一种新的纳米技术,设计出一种新型的青蒿琥酯-牛血清白蛋白纳米颗粒,实现了青蒿琥酯在线粒体的积累,诱导线粒体介导的肿瘤细胞调亡。Liu等5 首次制备转铁蛋白-8 臂聚乙二醇-二氢青蒿素纳米粒作为肿瘤靶向纳米粒给
13、药系统,并证实TF修饰的8 臂PEG-DHA纳米粒比游离DHA和未修饰的8 臂PEG-DHA纳米粒具有更强的抗肿瘤作用。本课题组6-8 采用超分子共组装方法制备青蒿素-丙酮层纳米药,共组装为2 个或2 个以上两亲物(脂质、表面活性剂、嵌段共聚物、纳米颗粒等)自发地合作或竞争性组织成更大或有序的复杂结构的过程。共组装具有许多优势,既可获得更加复杂的纳米结构,也可将更多的无法自组装结合的化合物进行整合9-10 丙酮层是以黄花蒿(Artemisia annua L.)为原料,在青蒿素工业提取过程中产生的废料,其成分复杂,本课题组前期分离得到2 0 个化合物,包括倍半烯(1个未见文献报道的新化合物)、
14、香豆素、多甲氧基黄酮等多个类型11-12 1,前期研究12-131 发现丙酮层及其主要成分多甲氧基黄酮(猫眼草黄素)均具有抗肿瘤-增敏双效作用,前者与抗肿瘤药物协同效应更强。但青蒿素与丙酮层水溶性均较差,尤其是后者几乎不溶于水,成药性差。鉴此,本研究对丙酮层-青蒿素进行共组装,以改善其难溶性问题,并采取乳化溶剂挥发法为主制备复方纳米药,结合反溶剂沉淀和超声分散等技术调整制备方案;通过有机溶剂种类筛选、油水比例调整、乳化剂浓度调整、超声功率调整,建立制备超分子共组装中药纳米复合粒子的通用方法;采用动态光散射(DLS)、傅里叶变换红外光谱仪、扫描电子显微镜(SEM)分别表征纳米粒子的粒径分布、Ze
15、ta电位、亲疏水性、特征峰以及微观形貌,根据试验结果调整配方设计,构建结构稳定、形貌均一的共组装纳米药;最后,考查共组装纳米药对CT26肿瘤细胞增殖和转移的影响,明确其抗肿瘤活性,为筛选候选抗肿瘤新药奠定基础。1材料与方法1.1试验材料二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、环已烷、甲醇、聚乙烯醇、NaOH(国药集团化学试剂公司);青蒿素(纯度98%,批号190 7 11Q,南京道斯夫生物科技公司);DMEM高糖培养基、CT26细胞(江苏凯基生物技术公司);青链霉素混合液(10 0 X)胰蛋白酶-EDTA消化液(0.2 5%胰蛋白酶,0.53mmolL-1EDTA,北京索莱宝科技公司);胎牛血清(美国C
16、LARKBioscience公司);丙酮层(青蒿素工业提取废料,重庆华立控股公司)1.2仪器220V/50Hz紫外可见分光光度计(北京因普恩国际贸易公司);SN-MS-3D磁力搅拌器(上海尚普仪器设备公司);(ptika倒置生物显微镜(意大利MAD公司);CO2培养箱、130 0 SERIESA2生物安全柜(赛默飞世尔科技公司);Vortex2涡旋仪(广州艾卡仪器设备公司)。1.3试验方法1.3.1共组装纳米粒子制备1.3.1.1有机相制备精密称取青蒿素5.0 0 mg和丙酮层物质10.0 0 mg,将其溶于2 ml有机溶剂(二氯甲烷、三氯甲、乙酸乙酯和环已烷)中,超声至完全溶解,制得有机相,
17、备用。1.3.1.2水相制备精细称取PVA2.5g于10 0 mL纯水中,置于搅拌仪上搅拌2 0 min,95水浴加热30 min,稍微冷却后继续搅拌至溶液透明均一,即得水相(2.5%PVA溶液)。取32 ml2.5%PVA溶液与48 mL纯水混合置于10 0 ml.烧杯内,制得1%PVA溶液,备用。1.3.4青蒿素丙酮层共组装纳米粒方包封率和载药量测定优火化分试86第45卷扬州大学命科学版)1.3.1.3初乳制备并乳化吸取2 0 mL水相,置于旋转仪上并放入转子,室温下将2 mL有机相在合适转速下逐滴加人水相中,搅拌即得初乳。初乳用超声波细胞破碎仪以适当的功率超声3min,开2 s停4s进行
18、乳化,乳化后溶液备用。1.3.1.4浓缩与收集吸取2 0 mL1%PVA溶液,置于旋转仪上并放人转子,室温下将乳化后溶液在合适的转速下缓慢滴入,搅拌4h,挥发有机溶剂。150 0 0 rmin1离心2 0 min,弃上清,以适量超纯水复溶沉淀,4保存备用。1.3.2共组装纳米药制备及青蒿素定量分析1.3.2.1溶液配制1)Na O H 溶液配制:制备2%NaOH溶液,备用。2)标准品溶液配制:吸取10 mL甲醇溶液于50 ml烧杯中,加人青蒿素10.0 0 mg,制成1.0mgmL-1对照品溶液。以母液进行梯度稀释,加人甲醇依次配制成浓度分别为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、10
19、 0.0 gml-的标准品溶液,备用。3)供试品溶液配制:将2 mL2%NaOH与1mL甲醇混合,置于离心管中作为空白对照,将2%NaOH与各浓度ART标准品溶液以2:1的比例混合,各取3mL置于离心管中,与空白对照组一同经50水浴加热30 min,取出冷却至室温,备用。1.3.2.2标准曲线绘制检测波长设定为2 92 nm,以2 mL2%NaOH与1mL甲醇混合液作为空白对照,测定不同浓度供品溶液的吸光度,以浓度(C)为横坐标、吸光度(D)为纵坐标绘制标准曲线。1.3.3处方单因素筛选与优化1.3.3.1有机溶剂筛选根据方法1.3.2,固定油水比例为1:10,乳化剂PVA浓度为2.5%,超声
20、功率为10 5W,拟选有机溶剂别为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯和环已烷时,分析纳米粒外观和粒径的变化。1.3.3.2乳化剂浓度筛选根据方法1.3.2,固定有机溶剂种类为二氯甲烷,油水比例为1:10,超声功率为10 5W,拟选乳剂浓度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%时,分析纳米粒外观和粒径的变化1.3.3.3油水比例筛选根据方法1.3.2,固定有机溶剂种类为二氯甲烷,乳化剂浓度为2.5%,超声功率为10 5W,拟选油比例为1:6、1:8、1:10、1:12、1:14时,分析纳米粒外观和粒径的变化1.3.3.4超声功率筛选根据方法1.3.2,固定有机溶剂种类为二氯甲烷,乳化剂浓度
21、为2.5%,油水比例为1:10,拟选超声功率为7 5、90、10 5、12 0、135W时,分析纳米粒外观和粒径的变化。向10 mL量瓶中加人一定量共组装纳米粒及适量甲醇破乳,超声溶解3min,涡旋振荡3min,加甲醇定容,超声波清洗器冰浴超声2 min,0.2 2 m滤膜过滤,取滤液,按方法1.3.2.1测定共组装纳米粒中青蒿素含量。另取等量共组装纳米粒溶液冻干,记录冻干后纳米粒质量。Ee/%=Cr/C.100;D i.=Cr/M,X10 0。式中:E为包封率(%);Dt.为载药率(%);C为纳米粒中药物量(mg);C为投药量(mg);M 为纳米粒质量(mg)1.3.5物象表征1.3.5.1
22、动态光散射(DLS)立仪进行粒径、Zeta电位、聚合物分散性指数测定运用马尔文纳米粒度电位仪进行粒径、Zeta电位、聚1.3.5.2扫描电子显微镜(SEM)对最优处方进行SEM拍摄,记录其纳米粒表观对最优处87李宛俞等:青蒿素-丙酮层共组装纳米药制备、表征及体外抗肿瘤初步评价第1期1.3.5.3傅里叶变换红外光谱仪方进行傅里叶变换红外光谱仪测定,记录其特征峰1.3.6体外抗肿瘤活性评价1.3.6.1细胞复苏将冻存的CT26细胞从一8 0 冰箱中取出,于37 水浴箱中水浴融化,向解冻后细胞迅速加人等体积完全培养基,吹打均匀后分装到1.5mL离心管中,37、8 0 0 rmin-1离心3min,弃
23、上清,加人完全培养基重悬,吹打均匀后移入培养瓶中进行培养。1.3.6.2细胞传代当细胞生长至融合度为8 0%90%时进行细胞传代。用移液器吸出原有培养基,用PBS清洗2 次以洗去细胞碎片及代谢物。加人胰酶消化至细胞变圆,加人完全培养基终止消化,吹打均匀后于37、800rmin-1离心3min。弃上清并重悬,以1:3的比例进行传代。1.3.6.3MTT试验CT26细胞经胰酶消化后进行细胞记数,以每孔2 0 0 L(每孔细胞数6 0 0 0 个)接种于3组96 孔板上继续培养。待细胞贴壁且状态良好时,将细胞分3组,即青蒿素单用组、丙酮层单用组、青蒿素-丙酮层共组装(1:2)纳米药组。青蒿素、丙酮层
24、单药皆稀释到以下浓度梯度(4.2 4、8.47、16.94、33.8 8、67.76、10 1.6 4mg L-),共组装组(以青蒿素浓度计)稀释到以下浓度梯度(4.2 4、8.47、16.94、33.8 8、67.76mgL-1)。每个药物梯度设3个平行组,以每孔10 0 l给药。另外,设置对照组(只加入基础培养基),加药后2 4h每孔加人50 LMTT试剂,孵育4h后弃去。而后,每孔加人150 LDMSO,避光静置1530 min。待甲瓒沉淀完全溶解后,于酶标仪上在波长490 nm处检测每孔吸光度。1.3.6.4划痕试验CT26细胞经胰酶消化后进行细胞记数,以每孔2 mL(每孔细胞数6 1
25、0 5个)接种于6 孔板上。待细胞贴壁且融合度达90%时,用2 0 0 L移液器枪头在6 孔板底部垂直划线,再以PBS清洗2 次,洗去划落的细胞。分别加人基础培养基与梯度稀释的青蒿素-丙酮层共组装纳米药(梯度稀释为4.2 4、8.47、16.94、2 5.41、33.8 8 m g L-1),每孔给药量2 mL。分别在0、12、2 4h使用倒置显微镜拍照,ImageJ软件测定划痕面积,计算划痕愈合率(H)。H/%=S。一S24/S。10 0,式中,S。为Oh划痕面积(cm);S2 为2 4h划痕面积(cm)。1.4统计与分析采用SPSS26.0统计软件进行分析,结果以士SD表示,组间比较采用G
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