生物样品前处置省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、生物样品前处理制作人:叶超第1页研究背景研究背景 1 234生物样品种类目录生物样品储存生物样品预处理克服基质效应方法第2页第3页DistributionMetabolismAbsorptionExcretion生物样品中药品分析测定是定量描述药品体内过程、取得药代参数主要伎俩之一第4页药品浓度低(血液中药品浓度、普通处于ng-pg级水平)干扰组分多(血液成份及其复杂,包含基质,内源性物质及其代谢产物,含有数百乃至几千种化合物)药品在体内除原型还有代谢产物以及和内源性物质结合各种形式存在体内生物样品分析特点体内生物样品分析特点第5页生物样品种类生物样品种类选取标准能够反应出药品浓度与药品效应之
2、间关系易于获取便于处理、适合分析依据不一样目标要求进行选取均匀生物样品生物样品种类血液(全血、血浆、血清)尿液、唾液、胆汁、乳汁、脑脊液、淋巴液、汗液等非均匀生物样品心、肝、肾、脾、肺、脑、胃、肠、子宫、肌肉、皮肤等组织、器官第6页全血全血全血包含液体成份血浆和分散悬浮于其中血细胞全血不易保留,且血细胞中含有很多干扰物质,影响测定,故较少用全血测定药品浓度。仅用于血浆药品浓度太低或者血浆药品浓度波动较大,且难以控制药品,如环抱霉素A。第7页血浆血浆将采取血液置含有抗凝剂(如肝素、EDTA)试管中,混合后,3000-4000r/min离心,分离红细胞,上清液即为血浆。测定血中药品浓度通常是指测定
3、血浆或血清中药品浓度,而不是指含有血细胞全血中 药品浓度。第8页血清血清血清是采血后不加任何抗凝剂,于室温下静置15-30min,待其自然凝结后,离心,分离出上清液。血清较血浆颜色更浅,较血浆少了大部分纤维蛋白,更易进行处理,且血浆及血清中药品浓度测定值通常是相同。第9页选择血浆or 血清u选择血浆理由:1)普通血浆中药品浓度高于血清中药品浓度2)血清形成过程中,血块凝固时,往往易造成吸附损失3)血清需要采血放置一段时间才可制得,对不稳定化合物影响较大4)血浆则可经采血后立刻离心,分离血浆低温保留u选择血清理由:1)血浆中蛋白稍微多,可能会在SPE中产生堵塞柱子情况2)血浆中含有抗凝物质(肝素
4、或EDTA)可能会干扰化合物检测第10页生物样品储存一、冷藏或冷冻采样后除了马上分析外,为预防药品发生改变,应:u短期保留,可4冷藏u长久保留,可-20冷冻,不要重复冻融(大部分药品)u-80,阿莫西林等抗生素二、有时,还应考虑加入稳定剂酶抑制剂:一些酯类药品,如普鲁卡因、阿糖胞苷,易受血浆酯酶作用而发生水解,而应在采样后马上加入酶抑制剂如氟化钠。抗氧化剂:一些易氧化物质,可加入VC或其它氧化剂。如血浆中儿茶酚类药品常规保留仅4周,若加入适量VC,则能保留10周。第11页盐酸班布特罗(前药)体内胆碱酯酶作用下迟缓代谢阻断水解毒扁豆碱(胆碱酯酶抑制剂)特布他林(代谢产物)生物样品储存和预处理(添
5、加酶抑制剂)第12页生物样品储存和预处理(避光)第13页生物样品储存和预处理(PH值和温度)第14页生物样品预处理目123将药品从缀合物(尿)或结合物中释放出来,以测定药品浓度将微量药品从复杂介质中纯化、富集起来预防分析仪器污染,提升测定灵敏度和选择性第15页生物样品惯用处理方法一二二三三沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)u主要考虑生物样品种类、被测药品性质和测定方法三个方面问题:第16页沉淀蛋白u经过沉淀蛋白质能够使结合药品释放出来,到达对待测组分提纯和纯化有机溶剂沉淀法加入中性盐有机酸加入锌盐或铜盐沉淀剂酶解法第17页有机溶剂沉淀法原理加入水溶性有机溶剂,可使蛋白质分子
6、内及分子间氢键发生改变惯用有机溶剂种类乙腈、甲醇、丙酮、乙醇、四氢呋喃等操作实例50l 血浆+150l甲醇 涡旋1min 3500rpm离心10min 取上清液进样分析第18页有机溶剂沉淀法实例奥氮平第19页有机溶剂沉淀法血浆或血清与有机溶剂体积比为1:13,就能够将90%以上蛋白质除去,采取低温低速3500r/min离心10min便可将析出蛋白质完全沉淀。经验总结优点操作简单,快速,精密度好,为方法开发中优先考虑使用,尤其在LC-MS方法中几乎使用于全部小分子化合物,不论其极性大小化合物回收率靠近100%,几乎全部小分子化合物都被提取,尤其适合用于代谢产物判定缺点只适合用于样品中浓度较高药品
7、测定;样品处理后依然存在很多干扰物质,对结果产生干扰;残余杂质会堵塞色谱柱,污染仪器第20页加入强酸原理当PH低于蛋白质等电点时,蛋白质以阳离子形式存在,加入强酸,可与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀。惯用有机溶剂种类10%三氯醋酸,10%高氯酸等经验总结血清与强酸百分比为1:0.6混合,高速离心,就可除去蛋白质在酸性条件下分解药品不宜本法除蛋白第21页头孢地尼内标 头孢克洛加入强酸实例第22页酶解法原理在测定酸不稳定及蛋白结合牢靠药品,需用酶解法,最惯用酶是蛋白水解酶枯草菌溶素,优点可防止一些药品在酸、及高温条件下降解:对与蛋白质结合牢靠药品(保泰松、苯妥英钠),可显著改进回收率第23页加入中性
8、盐原理加入中性盐,使溶液粒子强度发生改变。中性盐能将与蛋白质水合水置换出来,从而使蛋白质脱水而沉淀。惯用中性盐种类饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐操作实例血清和饱和硫酸铵百分比为1:2,混合,离心10000r/min 1-2min,即可除去90%以上蛋白质第24页生物样品惯用处理方法一二二三三沉淀蛋白(PPT)液液萃取(LLE)固相萃取(SPE)u主要考虑生物样品种类、被测药品性质和测定方法三个方面问题:第25页液-液提取方法(LLE)原理药品在体内吸收,需经跨膜转运,所以多数药品含有一定脂溶性生物样品中大多数内源性杂质是强极性水溶性物质u能够依据药品分子与基质之间极性差异,使用适当
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