生物工艺学省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

第二章第二章 菌种起源，生物活性物菌种起源，生物活性物质筛选和菌种保藏质筛选和菌种保藏第1页第一节第一节 菌种起源菌种起源第2页 微生物特征及工业微生物要求一、微生物特征q 有些微生物能在厌氧条件下生长q 有些微生物能够利用简单有机物和无机物满足本身 生长q 有些微生物能进行复杂代谢q 有些微生物能利用较复杂化合物q 有些微生物能在极端环境下生长第3页二：工业化菌种要求q 能够利用廉价原料，简单培养基，大量高效地合成 产物q 相关合成产物路径尽可能地简单，或者说菌种改造 可操作性要强q 遗传性能要相对稳定q 不易感染它种微生物或噬菌体q 产生菌及其产物毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）q 生产特征要符合工艺要求第4页一、工业生产惯用微生物*从自然界中分离出来就能被利用；对野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。使用重组DNA技术改造菌株当前育种总趋势 从野生菌转向变异菌从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组定向育种从诱发基因突变转向基因重组定向育种。工业生产惯用微生物第5页菌种起源菌种起源工业菌种种类？产物？第6页 因为发酵工程本身发展以及遗传工程介入，藻类藻类（alga）、病毒（）、病毒（virus）等也正在逐步地变为工业生产用生物。尽管如此，当前人们对微生物认识还是十分不够。已经初步研究不超出自然界微生物总量10%左右。微生物代谢产物据统计已超出一千三百各种，而大规模生产不超出一百各种；微生物酶有近千种，而在工业上利用不过四五十种。可见潜力是很大。在工业生产中惯用微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌细菌、酵母菌、霉菌细菌、酵母菌、霉菌细菌、酵母菌、霉菌和放线菌。和放线菌。和放线菌。和放线菌。第7页 工业生产惯用细菌有工业生产惯用细菌有 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)乳酸杆菌乳酸杆菌(Lactobacillus lactics)醋酸杆菌醋酸杆菌(Acetobacter)棒状杆菌棒状杆菌(Corynebacterium)短杆菌短杆菌(Brevibacterium)用于生产：用于生产：生产淀粉酶生产淀粉酶(amylase）蛋白酶（蛋白酶（proteinase）乳酸乳酸(lactic acid)醋酸醋酸(acetic acid)氨基酸氨基酸(amino acid)肌苷酸肌苷酸(inosinic acid)细菌（bacteria）：属于单细胞原核生物（unicellular prokaryote），），以经典二分分裂(binary)方式繁殖。细胞生长时细胞生长时，环状染色体（chromosome）被复制，细胞内蛋白质等组分同时增加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体被分开，继而间隔分裂形成两个相同子细胞。如间隔不完全分裂就形成链状细胞。第8页第9页第10页 1、惯用细菌、惯用细菌 大肠杆菌大肠杆菌 应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。应用：对谷氨酸定量分析，生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸。第11页 乳酸杆菌乳酸杆菌应用：乳酸、干酪、奶子酒、发面、泡菜、酸奶等制作n n 乳杆菌属乳酸杆菌科，因发酵糖产生大量乳酸而命名。存在广泛。嗜酸性，最适ph5.56.0,ph3.04.5仍能生存，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。肠道乳酸杆菌可分解糖产酸，抑制致病菌及腐败菌繁殖，乳酶生即由活乳酸杆菌制成，可治疗消化及腹泻。酸牛奶中乳酸杆菌也有抑制肠道致病菌作用。龋齿活动状态与唾液乳酸液杆菌计数之间有明确相互关系。第12页n n枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌n n应用：应用：-淀粉酶和中性蛋白酶主要生产菌；有菌株淀粉酶和中性蛋白酶主要生产菌；有菌株含有强烈降解核苷酸酶系，故常作选育核苷生产菌含有强烈降解核苷酸酶系，故常作选育核苷生产菌亲株或制取亲株或制取5-5-核苷酸酶菌种。核苷酸酶菌种。枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属一个。单个细胞 0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、各种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌嘌呤核苷酸合成路径与其调整机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。第13页 酵母菌（酵母菌（yeast）酵母菌为单细胞真核生物（unicellular eukaryote），在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖质较多酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜（nectar）和植物叶子上，以及果园土壤中。石油酵母（petroleum yeast）较多地分布在油田周围土壤中。酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。母细胞体积长到一定程度时就开始发芽。芽长大同时母细胞缩小，在母子细胞间形成隔膜，最终形成一样大小两个细胞。假如子芽不与母假如子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium)。工业上用酵母菌有：啤酒酵母啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、假丝、假丝酵母酵母(Candida)、类酵母、类酵母(Saccharomycodes)等，用于酿酒等，用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶（lipase），以及生产可食），以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。第14页真核细胞结构示意图真核细胞结构示意图第15页种类：酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母 红酵母、面包酵母 应用：生产酒精、啤酒、石油发酵脱蜡和制取蛋白质、生产脂肪第16页第17页啤酒酵啤酒酵母母红酵红酵母母啤酒酵母是啤酒生产上惯用经典上面发酵酵母。菌体维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料酵母，还能够从其中提取细胞色素C、核酸、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A和三磷酸腺苷等。最常提到酵母酿酒酵母（也称面包酵母）(Saccharomyces cerevisiae)，自从几千年前人类就用其发酵面包和酒类，在酦酵面包和馒头过程中面团中会放出二氧化碳。因酵母属于简单单细胞真核生物，易于培养，且生长快速，被广泛用于当代生物学研究中。如酿酒酵母作为主要模式生物，也是遗传学和分子生物学主要研究材料。第18页面包酵母面包酵母含蛋白质50左右，氨基酸含量高，富含B族维生素，还有丰富酶系和各种经济价值很高生理活性物质。几千年前人类就用面包酵母发酵面包和酒类，在当代食品工业方面，广泛用作人类主食面包、馒头、包子、饼干糕点等食品优良发酵剂和营养剂。低糖酵母发酵时，面团普通含糖量7左右，高糖酵母发酵时含糖量则为16。安琪酵母股份有限企业是专业生产面包酵母企业，产品涵盖全部面包酵母产品类型，安琪牌活性干酵母（低糖型、高糖型）出口全世界80多个国家 第19页 霉菌（霉菌（mould）霉菌不是一个分类学上名词。凡生长在营养基霉菌不是一个分类学上名词。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝真菌质上形成绒毛状、网状或絮状菌丝真菌(fungifungi)统称为霉菌。统称为霉菌。霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环空气、水和生物体内外等处。它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性境，大多数为好氧性(aerobiotic)aerobiotic)，多腐生，少多腐生，少数寄生。霉菌繁殖能力很强，它以无性孢子和数寄生。霉菌繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子繁殖为主。有性孢子进行繁殖，大多以无性孢子繁殖为主。第20页 生长方式是菌丝末端伸长和顶端分支，彼此交生长方式是菌丝末端伸长和顶端分支，彼此交织呈网状。菌丝长度即受遗传性控制，又受环境影响，织呈网状。菌丝长度即受遗传性控制，又受环境影响，其分支数量取决于环境条件。菌丝或呈分散生长，或其分支数量取决于环境条件。菌丝或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。呈菌丝团状生长。工业上惯用霉菌有：工业上惯用霉菌有：工业上惯用霉菌有：工业上惯用霉菌有：藻状菌纲根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲红曲霉，藻状菌纲根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲红曲霉，藻状菌纲根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲红曲霉，藻状菌纲根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲红曲霉，半知菌类曲霉、青霉等；半知菌类曲霉、青霉等；半知菌类曲霉、青霉等；半知菌类曲霉、青霉等；产品产品产品产品：酶制剂（酶制剂（酶制剂（酶制剂（enzyme preparationenzyme preparation）、抗生素）、抗生素）、抗生素）、抗生素(antibiotic)(antibiotic)、有机酸（、有机酸（、有机酸（、有机酸（organic acidorganic acid）及甾体激素）及甾体激素）及甾体激素）及甾体激素（steroid hormonesteroid hormone）等。等。等。等。第21页n n曲霉属曲霉属n n其中以其中以黄曲霉黄曲霉含有很强含有很强毒性毒性。绿色和黑色含有很。绿色和黑色含有很强强酶活性酶活性，在食品发酵中广泛用于制酱、，在食品发酵中广泛用于制酱、酿酒酿酒。当代发酵工业中用于生产当代发酵工业中用于生产葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶、糖化酶糖化酶和和蛋白酶蛋白酶等等酶制剂酶制剂。其它。其它菌株菌株有：黄曲霉（有：黄曲霉（A.A.flavusflavus），烟曲霉（），烟曲霉（A.fumigatusA.fumigatus），灰绿曲霉（），灰绿曲霉（A.A.glaucusglaucus），），构巢曲霉构巢曲霉（A.niduransA.nidurans），），寄生曲霉寄生曲霉（A.parasiticusA.parasiticus），土曲霉（），土曲霉（A.terreusA.terreus）和杂色曲）和杂色曲霉（霉（A.versicolorA.versicolor）等。）等。第22页n n应用：酱油、酱类（淀粉酶）应用：酱油、酱类（淀粉酶）n n产生黄曲霉毒素，不但能引发禽畜中毒致死，亦有致癌作用。第23页n n米曲霉米曲霉n n应用：应用：米曲霉是一类产米曲霉是一类产复合酶复合酶菌株菌株，除产蛋白酶，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、外，还可产淀粉酶、糖化酶糖化酶、纤维素酶纤维素酶、植酸酶植酸酶等。等。主要用于酿酒制曲和酱油制曲。主要用于酿酒制曲和酱油制曲。第24页应用：生产甲义丁二酸第25页 毛霉毛霉n n应用：能够产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆应用：能够产生蛋白酶，我国多用于豆腐乳、豆豉等制作。毛霉用途很广，常出现在酒药中，能豉等制作。毛霉用途很广，常出现在酒药中，能糖化糖化淀粉并能生成少许淀粉并能生成少许乙醇乙醇，产生，产生蛋白酶蛋白酶，有分，有分解解大豆蛋白大豆蛋白能力，我国多用来做能力，我国多用来做豆腐乳豆腐乳、豆豉豆豉。许多毛霉能产生许多毛霉能产生草酸草酸、乳酸乳酸、琥珀酸琥珀酸及及甘油甘油等，等，有毛霉能产生有毛霉能产生脂肪酶脂肪酶、果胶酶果胶酶、凝乳酶凝乳酶等。惯用等。惯用毛霉主要有鲁氏毛霉和毛霉主要有鲁氏毛霉和总状毛霉总状毛霉。第26页n n根霉根霉n n种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根种类：米根霉、华根霉、少根根霉、爪哇根霉霉n n应用：酿酒应用：酿酒根霉在自然界分布很广，用途广泛，其淀粉酶活性很强，是酿造工业中惯用糖化菌。我国最早利用根霉糖化淀粉（即阿明诺法）生产酒精。根霉能生产延胡索酸、乳酸等有机酸，还能产生芳香性酯类物质。根霉亦是转化甾族化合物主要菌类。与生物技术关系亲密根霉主要有黑根霉、华根霉和米根霉。第27页黑根霉，也叫面包霉。黑根霉，也叫面包霉。常寄生在面包和日常食品上，或混杂于培养基中，瓜果蔬菜等在运输和贮藏中腐烂及甘薯软腐都与其相关，菌丝体分泌出果胶酶，分解寄主细胞壁，感染部位很快会腐烂形成黑斑。黑根霉(ATCC6227b)是当前发酵工业上常使用微生物菌种。第28页青霉菌青霉菌有些种类如点青霉（P.notatum）和黄青霉（P.chrysogenum）等可提取青霉素，药用青霉素又称盘尼西林。灰黄青霉（P.griseofulvum）等可提取灰黄霉素。第29页应用：生产青霉素、葡萄糖氧化酶第30页 放线菌放线菌(Actinomycetes)放线菌因菌落呈放线状而得名。它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富微碱性土壤中较广。大多腐生，少数寄生。放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。后一个繁殖方式见于液体淹没培养（submerged cultures）中。其生长方式是菌丝末端伸长和分支，彼此交织成网状结构，成为菌丝体。菌丝长度即受遗传性控制，又与环境相关。第31页种类：种类：种类：种类：龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红龟裂链霉菌、金霉素链霉菌、灰色链霉菌、红霉素链霉菌霉素链霉菌应用：应用：应用：应用：各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉各类抗生素。土霉素、四环素、链霉素、红霉素。今年发觉一些抗肿瘤抗病毒抗生素。还是氨基酸、素。今年发觉一些抗肿瘤抗病毒抗生素。还是氨基酸、维生素、酶和酶抑制剂维生素、酶和酶抑制剂/除草剂除草剂/抗寄生虫等药品主要抗寄生虫等药品主要起源。起源。第32页 在液体淹没培养中因为搅拌器在液体淹没培养中因为搅拌器（agitatoragitator）剪应力作用，经常形成短分支旺剪应力作用，经常形成短分支旺盛菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生盛菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长。它最大经济价值在于能产生各种抗生素长。它最大经济价值在于能产生各种抗生素（antibioticsantibiotics）。）。）。）。从微生物中发觉抗生素，有从微生物中发觉抗生素，有60%60%以上是放线菌产生，如链霉素、红霉素、以上是放线菌产生，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。金霉素、庆大霉素等。惯用放线菌主要来自以下几个属：链霉惯用放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等。第33页放线菌分离放线菌分离n n土样采取？n n 游动放线菌n n小单孢菌n n嗜热放线菌n n嗜盐放线菌第34页 其它生物：其它生物：A:担子菌（担子菌（Basidiomycetes）：所谓担子菌就是人们通常所说菇类(mushroom)生物。担子菌资源利用正愈来愈引发人们重视，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药品开发。近几年来，日本、美国一些科学家对香菇抗癌作用进行了深入研究，发觉香菇中“1，2-葡萄糖苷酶”及两种糖类物质含有抗癌作用。第35页 B：病毒：病毒(virus)其特点以下：1.形体微小，体积比细菌小多。2.没有细胞结构，是一个独特分子生物，主要由核酸和蛋白质组成。3.营寄生生活，因为缺乏独立代谢酶体系，不能脱离寄主而自行生长繁殖，有专一性。人类免疫缺点病毒（human immunodeficiency virus，HIV）取得性免疫缺点综合症（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）第36页第37页 噬菌体（phage）是病毒一个。：烈性噬菌体和温和噬菌：烈性噬菌体和温和噬菌体概念与区分。体概念与区分。噬菌体在寄主细胞中生长繁殖过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放。第38页 C：藻类（：藻类（alga）：培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60吨，而种植大豆每公顷才可获4吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆28倍。培养珊列藻，从蛋白质产率计算，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦20-35倍。另外，还可经过藻类将CO转变为石油，培养单胞藻或其它藻类而取得石油，可占细胞干重得5%-50%,合成油与重油相同，加工后可转变汽油、煤油、和其它产品。有国家已建立培植单胞藻农场，每年每公顷地培植单胞藻按5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可得60吨石油燃料。此项技术应用，还可减轻因工业生产而大量排放CO造成温室效应。国外还有些人从“藻类农场”获取氢能报道，大量培养藻类，利用其光合放氢作用来取得氢能。第39页藻藻 类类 工工 厂厂第40页放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢细菌植物或动物起源一、抗生素生产相关微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂代谢，当前发觉生物起源以下：第二节 已工业化产品生产菌介绍第41页二、氨基酸生产相关微生物代谢控制发酵：用人工诱变方法，有意识地改变微生物代谢路径，最大程度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上一个转折点：第42页HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸合成调和异亮氨酸合成调整机制整机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶第43页氨基酸生产菌要求：代谢路径比较清楚，代谢路径比较简单谷氨酸发酵菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属棒型细菌常规菌种普通也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌第44页三、食品酶制剂生产相关微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA同意。当前已同意使用仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌第45页三、惯用基因表示系统(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌q 生长快速、蛋白产量高;q 表示蛋白纯化、分离及分析快速；q 外源基因导入相对轻易；q 已建立了整套表示理论及技术.第46页(二)真核细胞表示系统 酵母(既是微生物又是真核细胞)q 生长快速，营养要求不高，易培养；q 安全性好；q 比哺乳动物细胞操作简单；q 含有一定修饰蛋白能力。第47页 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表示系统q 含有准确转录后修饰功效；q 含有产物胞外分越功效，便于下游产物分离纯化；q 含有重组基因高效扩增和表示能力；q 含有贴壁生长特征，也可进行悬浮生长；q CHO极少分泌本身内源蛋白。第48页微生物（包含动、植物细胞）几乎能够生产我们所需一切产品，不过包括到工业化生产对于某一个特定产品，只有特定微生物才含有大量表示潜力。问题：生产抗生素微生物能不能用于生产氨基酸？礼来(Eli lilly),花了时间从40万株微生物中，发觉了三种有潜力新抗生素。例：第49页第三节 自然界中有目标微生物分离标准一、菌种分离普通过程土样采取土样采取 预处理预处理 培养培养 菌落选择菌落选择 产品判定产品判定怎样使样品中所含微生物可能性大怎样使样品中所含微生物可能性大怎样在后续操作中使这种可能性实现怎样在后续操作中使这种可能性实现目标：目标：高效地获取一株高产目标产物微生物高效地获取一株高产目标产物微生物问题问题：第50页 在筛选所需菌种时应考虑一些主要指标：在筛选所需菌种时应考虑一些主要指标：（1 1）菌种营养特征：菌种营养特征：（2 2）菌种生长温度：菌种生长温度：（3 3）菌种对所采取设备及生产过程适应性：菌种对所采取设备及生产过程适应性：（4 4）菌种稳定性：菌种稳定性：（5 5）产物得率和产物浓度：产物得率和产物浓度：（6 6）产物轻易回收：产物轻易回收：能满足（能满足（3 3）（6 6），则有希望成为效益较高生产菌种。），则有希望成为效益较高生产菌种。第51页二、采样时要注意问题q 气候、水分、空气q 起源q 结合产品特点q 标签：地点、时间、气候等第52页富集三种方案：q 定向培养:采取特定有利于目标微生物富集 条件，进行培养。三、目标微生物富集一些基本方法富集目标：让目微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。q 当不可能采取定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，q 不能提供任何有利于筛选产生菌信息，这 时只能经过随机分离方法第53页第54页n n分解纤维素细菌分离n n分解醛肟细菌分离 第55页四、菌落选出q 从产物角度出发在培养时以产物形成有目标设计培养基在培养时以产物形成有目标设计培养基利用简单、快速判定方法，如抗生素利用简单、快速判定方法，如抗生素q 从形态角度 菌菌落落外外观观形形态态，是是微微生生物物一一个个主主要要表表征征。如如多多糖糖产产生生菌菌在在适适当当培培养养基基上上生生长长，从从含含有有粘粘液液性性菌菌落落外外观观上上就就能能够够初步识别。初步识别。第56页实例：碱性纤维素酶产生菌筛选（国家七五攻关项目）实例：碱性纤维素酶产生菌筛选（国家七五攻关项目）采样（造纸厂）采样（造纸厂）80度度30分钟处理分钟处理文件文件:产生菌为中性牙孢杆菌，产生菌为中性牙孢杆菌，嗜碱牙孢杆菌嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝曲利本蓝1%CMC（羧甲基纤维素），（羧甲基纤维素），pH10.5培养培养34天，选择有凹陷圈菌落天，选择有凹陷圈菌落从从285个土样中取得个土样中取得62株株26株为组成型株为组成型36株为诱导型株为诱导型第57页例：醛肟水解酶筛选例：醛肟水解酶筛选 -Journal of biotechnology 94(),65-72培养基中含0.05%of Z-PAOx 每隔2-3天移去二分之一培养物，补充新鲜培养基不停分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落第58页第二节第二节 生物活性物质筛选生物活性物质筛选第59页降降血脂血脂活性化合物筛选活性化合物筛选抗动脉粥样硬化药品抗动脉粥样硬化药品血浆中血浆中胆固醇胆固醇胆固醇胆固醇起源有外源性和内源性两种路径。外起源有外源性和内源性两种路径。外源性胆固醇主要来自源性胆固醇主要来自食物食物，可经过调整，可经过调整食物结构食物结构食物结构食物结构来控制摄入量；内源性则在来控制摄入量；内源性则在肝脏肝脏肝脏肝脏中合成。在中合成。在肝细肝细肝细肝细胞胞胞胞细胞质细胞质细胞质细胞质中，由中，由乙酸乙酸经经2626步步生物合成生物合成生物合成生物合成步骤合成内步骤合成内源性胆固醇。源性胆固醇。第60页 1.降血脂药（降血脂药（Lipid-lowering drugs）（1 1）影响胆固醇合成影响胆固醇合成:HMG-CoA还原酶抑制剂还原酶抑制剂 洛伐他汀（洛伐他汀（lovastatin）、辛伐他汀、辛伐他汀(sinvatatin)（2）影响胆固醇吸收和转化影响胆固醇吸收和转化:胆汁酸结合树脂胆汁酸结合树脂 考来烯胺考来烯胺(colestyramine)（3）影响脂蛋白合成、转运及分解影响脂蛋白合成、转运及分解：苯氧酸类苯氧酸类:氯贝特氯贝特(clofibrate),吉非贝齐吉非贝齐(gemfibrozil)烟酸类：烟酸类：烟酸烟酸(nicotinic acid)3.3.多不饱和脂肪酸类：多不饱和脂肪酸类：亚油酸等亚油酸等 4.4.保护动脉内皮药：保护动脉内皮药：硫酸软骨素硫酸软骨素A A 2.2.抗氧化药：抗氧化药：普罗布考（普罗布考（probucolprobucol）第61页HMG-CoA 还原酶抑制药：还原酶抑制药：n n3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMGCoA）还原酶抑制药，又称为他汀类药（statins），从霉菌培养液中提取，用于临床有洛伐他汀（lovastatin）、普伐他汀（pravastatin）、辛伐他汀（simvastatin）以及人工合成氟伐他汀（fluvastatin）、阿伐他汀（atorvastatin）等第62页n nHMG-CoA HMG-CoA 还原酶是合成胆固醇限速酶，他汀类结构与还原酶是合成胆固醇限速酶，他汀类结构与HMG-CoAHMG-CoA相同，对酶亲和力比相同，对酶亲和力比HMG-CoA HMG-CoA 高高10,000 10,000 倍，所倍，所以能在肝脏竞争抑制以能在肝脏竞争抑制HMG-CoA HMG-CoA 还原酶，还原酶，从而妨碍内源性从而妨碍内源性胆固醇合成，降低血浆总胆固醇水平胆固醇合成，降低血浆总胆固醇水平 。第63页洛伐他汀洛伐他汀（lovastatin）【不良反应不良反应】1.胃肠道反应、头痛或皮疹。胃肠道反应、头痛或皮疹。2.转氨酶升高转氨酶升高用药后用药后1 6个月检测肝功效。个月检测肝功效。3.骨骼肌溶解症骨骼肌溶解症:肌痛、肌球蛋白尿、肾功效肌痛、肌球蛋白尿、肾功效衰竭，在适用免疫抑制剂环孢素或降血脂药衰竭，在适用免疫抑制剂环孢素或降血脂药烟酸、吉非贝齐时较易发生。烟酸、吉非贝齐时较易发生。4.孕妇及哺乳妇女禁用。孕妇及哺乳妇女禁用。第64页降血脂药品降血脂药品n n胆酸整合剂 n nHMGCoA还原酶抑制剂 n n烟酸及其衍生物 n n贝特类Fibrates n n普罗布考Probucoln n泛硫乙胺(Pantethine)n n弹性酶弹性酶(Elastase)n nOmega3脂肪酸脂肪酸。第65页Molecular drug designn n 创制新药四要素n n 生物靶标选择生物靶标选择n n 检测模型确实定检测模型确实定n n 先导化合物发觉先导化合物发觉n n 先导化合物优化先导化合物优化第66页Molecular drug designn n药品分子设计由多学科相互穿插，交替进行药品设计学药品设计学分子生物学分子生物学结构生物学结构生物学基因组基因组生物信息学生物信息学数学数学统计学统计学药品化学药品化学有机药品化学有机药品化学计算机科学计算机科学计算化学计算化学分子药理学分子药理学普通药理学普通药理学第67页 Introductionn n新药研发 R&D of New Drugsn n新药新药n n新药研发过程新药研发过程n n新药研发包括学科新药研发包括学科n n新药研发特点新药研发特点n n药品分子设计 Molecular Drug Designn n概念及内容概念及内容n n先导化合物 Lead Compound第68页第69页先导化合物先导化合物 Lead compoundn n简称先导物（Lead），是指新发觉对某种靶标和模型展现明确药理活性化合物。n n应与 hit 相区分第70页Lead compoundsn nA lead is a representative of a compound series with sufficient potential(as measured by potency,selectivity,pharmacokinetics,physicochemical properties,novelty,and absence of toxicity)to progress to a full drug development program.第71页药品分子设计策略基础药品分子设计策略基础n n分子多样性、互补性和相同性组成了设计方法分子多样性、互补性和相同性组成了设计方法策略基础策略基础n n分子分子多样性（多样性（diversitydiversity）是先导物发觉物质基础是先导物发觉物质基础n n分子分子互补性（互补性（complementaritycomplementarity）是分子识别和受体是分子识别和受体-配体结合基础和推进力配体结合基础和推进力n n分子分子相同性（相同性（similaritysimilarity）在不一样层次上有不一样含在不一样层次上有不一样含义义第72页先导物发觉先导物发觉先导物优化先导物优化互补性互补性相同性相同性多样性多样性包容性包容性反相同性反相同性不相同性不相同性第73页Lead discoveryn n分子多样性分子多样性n n天然生物活性物质天然生物活性物质n n组合化学组合化学n n组合生物合成和组合生物催化组合生物合成和组合生物催化n n基于临床副作用观察产生先导物基于临床副作用观察产生先导物n n虚拟筛选虚拟筛选n n分子互补性分子互补性n n基于生物大分子结构和作用机理药品分子设计基于生物大分子结构和作用机理药品分子设计n n反义寡核苷酸反义寡核苷酸第74页Lead discovery and optimizationn n分子相同性n n基于内源性配体分子药品设计基于内源性配体分子药品设计n n过渡态类似物过渡态类似物n n肽模拟物肽模拟物n n生物电子等排置换生物电子等排置换n n类似物变换类似物变换n n药品合成中间体药品合成中间体n n基于代谢转化基于代谢转化第75页天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n 天然生物活性物质起源广泛n n 植物植物n n 动物动物n n 微生物微生物n n 海洋生物海洋生物n n 矿物矿物第76页第77页天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n 天然生物活性物质特点n n 新奇结构类型（分子多样性）新奇结构类型（分子多样性）n n 独特药理活性独特药理活性n n 资源有限及地域性差异资源有限及地域性差异n n 有效成份含量很低有效成份含量很低n n 大多数结构复杂，作用强度不一样大多数结构复杂，作用强度不一样第78页天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n青蒿素青蒿素青蒿素Artemisinin黄花蒿黄花蒿Artemisia annula蒿甲醚蒿甲醚Artemether生物利用度较低生物利用度较低复发率高复发率高第79页天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n喜树碱羟基喜树碱羟基喜树碱Hydroxycamptothecin喜树喜树Camptotheca acuminata拓扑替康拓扑替康Topotecan水溶性较差，毒性大水溶性较差，毒性大第80页天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n紫杉醇紫杉醇紫杉醇Taxol红豆杉红豆杉Taxus紫杉特尔紫杉特尔Taxotere第81页紫杉特尔紫杉特尔n n与紫杉醇相比，紫杉特尔水溶性较大，毒性较小，与紫杉醇相比，紫杉特尔水溶性较大，毒性较小，但疗效相当。已由法国但疗效相当。已由法国RhonePoulencRoreRhonePoulencRore企业生产，企业生产，美国美国FDAFDA于于19961996年同意上市，以多乙氧基醚年同意上市，以多乙氧基醚（polysorbate-80polysorbate-80）助溶制成针剂，用于治疗乳腺）助溶制成针剂，用于治疗乳腺癌，尤其是当化疗失败后可再用它治疗。紫杉特癌，尤其是当化疗失败后可再用它治疗。紫杉特尔在敏感细胞中抑制微血管解聚作用为尔在敏感细胞中抑制微血管解聚作用为paclitaxel paclitaxel 2 2倍，在动物和人癌细胞株中杀伤作用为倍，在动物和人癌细胞株中杀伤作用为paclitaxelpaclitaxel1.3121.312倍，而且对倍，而且对paclitaxelpaclitaxel耐药细胞活性耐药细胞活性比比paclitaxelpaclitaxel强数倍。自强数倍。自19901990年在欧洲开始临床研究年在欧洲开始临床研究以来，已在欧美，日本和我国完成以来，已在欧美，日本和我国完成期临床试验。期临床试验。初步观察对乳腺癌、卵巢癌、肺癌都有效，是一初步观察对乳腺癌、卵巢癌、肺癌都有效，是一受到广泛重视新药受到广泛重视新药 第82页天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n局麻药可卡因可卡因Cocaine南美洲古柯南美洲古柯Erythroxylum coca Lam普鲁卡因普鲁卡因Procaine第83页天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n抗生素类天然抗生素天然抗生素微生物培养液微生物培养液半合成抗生素半合成抗生素第84页天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n他汀类降脂药美伐他汀美伐他汀Mevastatin洛伐他汀洛伐他汀 Lovastatin辛伐他汀辛伐他汀Simvastatin普伐他汀普伐他汀Pravastatin桔青霉菌等桔青霉菌等Penicillium citrinum氟伐他汀氟伐他汀Fluvastatin第85页氟伐他汀氟伐他汀n n完全经化学合成完全经化学合成3 3羟基羟基3 3甲基戊二酰辅酶甲基戊二酰辅酶A(HMGA(HMGCoA)CoA)还原酶抑制剂类降血脂新药，与还原酶抑制剂类降血脂新药，与普普伐他汀伐他汀类似，其无需代谢转化而直接含有药理活类似，其无需代谢转化而直接含有药理活性。本品氟苯吲哚部分仿拟辅酶，能与性。本品氟苯吲哚部分仿拟辅酶，能与HMGHMGCoACoA还原酶相互作用，竞争性抑制这一催化还原酶相互作用，竞争性抑制这一催化HMGHMGCoACoA转化为甲羟戊酸胆固醇生物合成限速转化为甲羟戊酸胆固醇生物合成限速酶，降低细胞内胆固醇贮量，增加低密度脂蛋白酶，降低细胞内胆固醇贮量，增加低密度脂蛋白胆固醇胆固醇(LDL(LDLC)C)受体数量，恢复细胞内胆固醇代受体数量，恢复细胞内胆固醇代谢稳态，并加速从血浆中去除谢稳态，并加速从血浆中去除LDLLDLC C。本品为右。本品为右旋旋(强活性强活性)和左旋和左旋(弱活性弱活性)组成消旋体，前者活性组成消旋体，前者活性强强3030倍。倍。第86页天然生物活性物质作为先导物天然生物活性物质作为先导物n n动物毒素n n蛇毒蛇毒BungarotoxinBungarotoxin，NN2 2受体拮抗剂受体拮抗剂肌松药肌松药n n蛇毒蛇毒BatroxobinBatroxobin，溶血栓酶，溶血栓酶抗栓药抗栓药n n鱼毒鱼毒TetrodotoxinTetrodotoxin，钠通道阻断剂，钠通道阻断剂心血管药品心血管药品n n蜂毒蜂毒ApaminApamin，钙通道阻断剂和钾通道开放剂，钙通道阻断剂和钾通道开放剂心血管药品心血管药品第87页组合化学组合化学Combinatorial chemistryn n同时制备含众多分子化合物库n n以代数级数增加构建块数目，库容量则以几何以代数级数增加构建块数目，库容量则以几何级数增加级数增加n n与高通量筛选（high-throughput screening,HTS）技术结合，可极大地加紧先导物发觉和优化速度第88页组合合成组合合成Combinatorial synthesisn n平行合成和混分合成n n固相合成和液相合成n n小分子组合合成n n计算机辅助设计及虚拟库合成n n八学期选修课“组合化学与新药研究”第89页组合生物合成组合生物合成Combinatorial biosynthesisn n基本原理基因变异（混合、匹配、交换、突变等）基因变异（混合、匹配、交换、突变等）基因克隆基因克隆各种变异酶系各种变异酶系各种非天然天然物质各种非天然天然物质第90页聚酮合酶催化合成红霉素聚酮合酶催化合成红霉素第91页组合生物催化组合生物催化Combinatorial biocatalysisn n基本原理变异酶系或微生物酶系变异酶系或微生物酶系催化小分子化合物转化催化小分子化合物转化各种人工天然化合物各种人工天然化合物第92页岩白菜内酯生物催化组合库岩白菜内酯生物催化组合库 第93页基于临床副作用观察产生先导物基于临床副作用观察产生先导物n n 作用与作用与 作用分离作用分离第94页异丙嗪镇静作用异丙嗪镇静作用 Promethazine异丙嗪（抗过敏药）异丙嗪（抗过敏药）Chlorpromazine氯丙嗪（安定）氯丙嗪（安定）Thiazinamium噻丙胺（支气管扩张）噻丙胺（支气管扩张）第95页磺胺家族发展磺胺家族发展第96页单氨氧化酶抑制剂发觉单氨氧化酶抑制剂发觉第97页格鲁米特芳构酶抑制作用格鲁米特芳构酶抑制作用第98页筛选发觉先导物筛选发觉先导物n n随机与非随机筛选 Random/nonrandom screeningn n高通量筛选 High-throughput screening(HTS)n n虚拟筛选 Virtual