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高通量测序在生物学的应用省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、高通量测序技术在生物学中应用第1页主要汇报内容高通量测序介绍高通量测序介绍从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用第2页HGP项目:20世纪90年代美国能源部资助开启人类基因组计划,六个国家科学家耗资4.37亿,于完成人类基因组工作草图。方法和结果:应用分层shotgun+Sanger测序法,结果预测了31,000个基因,证明基因组95%是非编码序列。意义:人类基因组测序完成标志着分子医学时代到来;此项目也催生了高通量测序技术。Nature()409:860-921人类基因组从头测序分析人类基因组从头测序分析分层shotgun测序法第3页Sanger测序技
2、术测序技术PCR末端终止技术+电泳检测技术单个片段序列测定最高通量:小于4MB/天基于平板胶测序技术96通道毛细管阵列第4页高通量测序技术高通量测序技术 Shot Gun Shot Gun文库构建文库构建DNADNA片段固定片段固定簇序列读取反应簇序列读取反应图像取得和处理图像取得和处理序列组装和比较序列组装和比较单条模板扩增单条模板扩增1234T T T T T G C T 第5页123789456T T T T T T T G T T G C T A C G A T 高通量测序技术高通量测序技术第6页主要测序技术平台主要测序技术平台Metzker,Nature Reviews Geneti
3、cs()11:31第7页主要汇报内容高通量测序介绍从头测序及其应用从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用第8页454技术完成5倍测序深度;GAII技术完成20倍测序深度;Sanger技术完成6倍覆盖度(Dalloul et al.PLoS Biol()8:e1000475)各种技术平台联合应用完成火鸡基因组从头测序各种技术平台联合应用完成火鸡基因组从头测序测序数据统计第9页火鸡基因组从头测序火鸡基因组从头测序结果:覆盖火鸡基因组 90%(0.92/1.1Gb),发觉6M SNP,预测 16K个基因。火鸡和家鸡测序拼接结果第10页火鸡基因组从头测序火鸡基因
4、组从头测序发觉了数千个禽类特有基因,尤其是性染色体基因研究令人兴奋。禽类中特有基因第11页火鸡基因组从头测序火鸡基因组从头测序为研究者提供火鸡质量和数量生产性状和抗病候选基因,加速了火鸡育种进展。与家鸡基因组比较火鸡基因组中20种基因家族分布情况三种鸟类基因比对结果四种禽类不一样氨基酸含量情况第12页意意义义:第一个完全利用高通量测序技术模式完成动物基因组从头测序;方方法法和和结结果果:不一样插入片段测序文库双末端测序技术尝试:包含150bp、500 bp、2 kb、5 kb 和10 kb不一样插入片段,测序深度达73倍,覆盖94%基因组区域;取得2.7M SNP位点,证实大熊猫依然具备很高杂
5、合率和较高遗传多态性;Li et al.,Nature()463:311-317 大熊猫基因组从头测序和组装大熊猫基因组从头测序和组装第13页大熊猫基因组从头测序和组装大熊猫基因组从头测序和组装利用9个Sanger测序BAC序列评价测序质量,表明98%BAC序列能够比对到scaffold上预测大熊猫约有21001个基因大熊猫与人、狗和鼠基因进化分析测序数据与BAC序列比较第14页构建不一样长度插入片段文库高通量测序基因组杂合度分析覆盖基因区预计得到框架图或更高覆盖度500bp fragment文库Paired-end测序,测序深度到达40以上3KB Mate pair文库Paired-end测
6、序,测序深度到达60以上10KB Mate pair文库Paired-end测序,测序深度到达80以上基因杂合度5%,同时开启BAC-to-BAC测序基因组从头测序经典策略第15页从头测序数据分析和产出指指标标框架框架图图 覆盖基因组常染色体区域90%,覆盖基因区域95%,contig N50抵达5Kb,scaffold N50抵达20Kb,单碱基错误率在万分之一以下精精细图细图 覆盖基因组常染色体区域95%,覆盖基因区域98%,contig N50抵达20Kb,scaffold N50抵达300Kb,单碱基错误率在万分之一以下完成完成图图 完整基因组序列,单碱基错误率在十万分之一以下从头测序
7、覆盖度指标从头测序覆盖度指标从头测序主要数据分析从头测序主要数据分析原始数据比对组装结果统计覆盖度、深度评价基因注释比较基因组及进化分析第16页蓝藻 1 Mb线虫 100 Mb果蝇100 Mb人 3,000 Mb基因和基因组进化小鼠 3,000 Mb第17页生物进化谱系树生物进化谱系树大鼠、小鼠、狗、大熊猫、牛家鸡、火鸡斑马鱼拟南芥、水稻、杨树、酿酒葡萄、短柄草、黄瓜、高粱、玉米1535个细菌基因组、49个真菌基因组和78个古细菌 利什曼原虫、椎体虫四类蓝藻隐藻蜜蜂第18页单分子测序技术及其对从头测序影响单分子测序技术及其对从头测序影响单分子实时测序,无需PCR扩增运行时间15min或者更短,
8、读长到达5-50K,数据产出100-1000G;使人类基因组测序成本低于1000美元第19页主要汇报内容高通量测序介绍从头测序及其应用重测序及其应用转录组测序及其应用Small RNA测序及其应用第20页瑞士和美国科学家对8个家鸡品系和1个野生品系进行测序该研究能够用于动物育种及提升家鸡在生物医药研究模式动物中应用Rubin et al.,Nature()464:doi:10.1038经过全基因组重测序分析鸡驯养过程中位点选择第21页经过全基因组重测序分析鸡驯养过程中位点选择测序完成44.5倍测序深度,测序覆盖度达92%发觉7,000,000 SNP位点,约1,300插入/缺失位点研究发觉基因
9、功效缺失突变在鸡驯养过程中没有显著性作用缺失影响编码区基因测序数据统计第22页筛选到两个基因GHR(以前验证)和SH3RF2在育种中含有功效在400个F8群体中分析SH3RF2缺失对鸡体重影响表明SH3RF2是筛选不一样鸡品系一个主要指标经过全基因组重测序分析鸡驯养过程中位点选择分析SH3RF2基因第23页中科院上海生命科学院、北京基因组所 等六家科研机构对150个水稻RIL系进行测序利用Illumina GA,每16个样一个道,以3个碱基为标签,测序读长为36碱基,每个样测序深度约0.02倍第一次利用全基因组重测序筛选SNP位点,对群体进行表型分析利用全基因组重测序分析表型差异第24页利用全
10、基因组重测序分析表型差异分析两个亲本基因组差异发觉1,226,791 SNP位点,即3.2 SNPs/kb分析150个RILs发觉了1,493,461 SNP位点,即1 SNP/40kb试验设计第25页与以前该RILs重组图谱比较分析,在150个RILs中判定出2334个重组框,平均每个框大小约164 kb利用sliding window方法分析SNP位点与表型间关系与重组位点利用全基因组重测序分析表型差异Sliding window方法第26页分析株高,共判定出4个QTL,其中贡献率最强1个QTL位点含有一个sd1基因,该基因在已被报道。表明利用全基因组重测序能够进行准确QTL定位及基因定位
11、利用全基因组重测序分析表型差异第27页重测序生物信息学分析内容重测序生物信息学分析内容第28页Genetech企业(已被罗氏制药收购)生物信息学与计算机生物学部,与Complete Genomics企业合作对一名烟龄超出,平均天天吸烟25根原发性肺部肿瘤患者进行分析,将这名患者癌细胞和相邻正常组织基因组进行测序对癌细胞完成了60倍测序深度,相邻正常组织完成了46倍测序深度。(Lee et al.Nature()465:473)肺癌组织比较基因组学研究肺癌组织比较基因组学研究测序数据统计第29页肺癌组织比较基因组研究发觉了超出5万个基因点突变,其中530个得到确认,它们当中392个在编码区域,包
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