143、糖化酶菌种岗位标准操作规程.doc
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4、日期: 签名:变更记载:修 订 号 批 准 日 期 执 行 日 期 变更原因及目的:发放部门:生产部 品质管理部 发酵车间1、目的:建立糖化酶生产种子岗位操作规程,使种子工严格操作,确保种子质量及无菌。2、适用范围:适用于种子岗位 。3、责 任 者:种子操作人员。4、正 文:1.菌种工艺流程:甘油管淀粉平板半干体种子摇瓶种子罐原始菌种先接入淀粉平板半干体纯化后由半干体接入甘油管.2.培养基制备:2.1甘油管制备: 在50或100ml三角瓶中配置50%浓度的甘油乳液,121,0.11Mpa40分钟灭菌2次,放无菌室备用,备用期不能超过10天。如果已经使用过,在下次使用时仍需灭菌;用玻璃小试管(1
5、0100)或塑料小试管洗净烘干,121,0.11Mpa40分钟灭菌2次后备用;糖化酶用半干体做甘油管,即在无菌条件下吸取1-2ml半干体于小试管内,同时吸取等量备用50%的甘油于小试管中,塞好胶塞,充分摇匀。此时的甘油浓度为20%或略高,如果浓度太高不能冷凝,太低细胞容易破碎不能保藏。一般情况放入-80冰箱保藏半年或一年,时间不能太长。2.2淀粉平板的制备:淀粉培养基(淀粉平板) 蛋白胨 1.0% 酵母粉 0.2%牛肉粉 0.3% NaCL 0.2%玉米淀粉 1.0% 琼脂粉 1.7%称量完毕后定容到所需体积,用稀盐酸调PH到5.8-6.1,煮沸使琼脂溶解,121、30分钟灭菌,冷却到50倒平
6、板,每皿20-25ml。分离时用移液管吸取0.1ml-0.2ml半干体种子涂布于培养基中,331, 培养4-5天. 技术要求:单菌落要多,呈褶皱,盆地状.2.3察氏平板的制备:蔗糖 3% 硝酸钠 0.2%磷酸氢二钾 0.1% MgSO47H2O 0.05%FeSO47H2O 0.001% KCL 0.05% 琼脂粉 1.7%称量完毕后定容到所需体积,用稀盐酸调PH到5.8-6.1,煮沸使琼脂溶解,121、30分钟灭菌,冷却到50倒平板,每皿18-20ml。将淀粉平板中典型菌落涂布于培养基中,331 培养4-5天. 技术要求:菌苔厚,无杂菌污染,灰色带红2.4半干体培养基蔗糖 3% 硝酸钠 0.
7、2%磷酸氢二钾 0.1% MgSO4.7H2O 0.05%FeSO4.7H2O 0.001% KCL 0.05% 琼脂粉 0.05%称量完毕后定容到所需体积,用稀盐酸调PH到5.8-6.1,煮沸使琼脂溶解,121、30分钟灭菌,将察氏平板中典型菌苔刮入培养基中,34 培养4-5天.培养期间每天每6小时顺时针摇3-4圈。2.5种子摇瓶制备:豆饼粉 2%玉米浆 2%玉米淀粉 12%高淀 0.05%豆粉单独称量倒入瓶中,玉米淀粉加热煮沸液化10分钟,每瓶装量150ml/500ml,121、40分钟灭菌.将半干体在无菌条件下吸入10-15ml.上摇床,转速300转/分钟,33-34培养2-3天.3.火
8、焰保护法接种小罐 3.1 准备工作,酒精棉球一瓶,镊子、火柴、喷雾器。 3.2 小罐接种:罐温降至32时,用75%酒精棉球消毒接种口及用5%石碳酸喷雾消毒小罐周围的空气,然后在小罐接种口点燃酒精棉灭菌,关闭接种葫芦靠罐阀,拧开接种帽,不要将其拿出火焰保护范围,将装有种液的摇瓶在火焰保护下迅速倒入接种葫芦内,拧上接种帽.打开靠罐阀,调整罐压使之升到0.08MPa,再缓慢降至0.03MPa,反复数次,利用压差法将种液接入罐内.4. 无菌试验 4.1 固体、液体细菌培养基的制备方法原料名称固体配方(%)液体配方(%)葡萄糖-0.3牛肉膏0.50.3蛋白胨0.61.0氯化钠0.50.5酚 红-0.4琼
9、 脂2.02.2-PH7.07.27.07.2 4.2 固体培养基的配制 4.2.1 称取牛肉膏,蛋白胨于烧杯中,加适量水、加热搅匀溶解后加至需要量水,然后用10%NaOH调节PH值(用PH计测定)。 4.2.2 将调好PH值的固体培养基分装在三角瓶中(1000ml瓶装量200ml) 加琼脂,包扎好消毒,压力为0.100.11MPa温度1211, 时间30分钟。 4.2.3 消毒后的固体培养基自然冷却至50左右在无菌条件下倒碟,每支双碟装量2025 ml不易太厚或太薄,凝固移入恒温室培养24-48小时, 检查无菌方可使用。5 取无菌样 5.1 种子罐每隔8小时取无菌样一次,划无菌平板2个。大罐
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