湖南省两栖动物新纪录——桂北琴蛙.pdf

Chinese Journal of Wildlife 2024，45（2）：448-455Chinese Journal of Wildlifehttp：/湖南省两栖动物新纪录桂北琴蛙程彦林1，刘京1，2，周铝1，周军健1，李仕泽1，2*（1.茅台学院资源环境系，仁怀，564500；2.贵州大学林学院，贵阳，550025）摘 要2023 年 5 月 26 日，在湖南省新宁县崀山镇（261940 N，1104254 E；海拔 441 m）进行两栖动物调查时，采集到4号琴蛙属（Nidirana）物种标本，经形态特征比较，与桂北琴蛙（Nidirana guibeiensis）相似；基于线粒体COI基因构建的琴蛙属部分物种系统发育树显示，此次采集的琴蛙标本与桂北琴蛙聚为一支，且具有较高的支持率（1.00/99）；基于Kimura双参数模型估算本次采集的琴蛙标本与模式产地（广西兴安）标本间的遗传距离为0，远小于琴蛙属物种间的遗传距离（2.7%14.4%）。综合形态学和系统发育比较，确定此次采集的琴蛙标本为无尾目（Anura）蛙科（Ranidae）琴蛙属的桂北琴蛙，系湖南省两栖动物分布新纪录种。A New Amphibian Distribution Record of Nidirana guibeiensis in Hunan ProvinceCHENG Yanlin1，LIU Jing1，2，ZHOU L1，ZHOU Junjian1，LI Shize1，2*（1.Department of Resources and Environment，Moutai Institute，Renhuai，564500，China；2.College of Forestry，Guizhou University，Guiyang，550025，China）Abstract：During the amphibian survey in Langshan Town（2619 40 N，11042 54 E；altitude 441 m），Xinning County，Hunan Province，China on 26 May，2023，four Nidirana specimens were collected.We compared the specimens with the known congeners and found that the specimens from Hunan were similar to Nidirana guibeiensis.We further constructed the phylogenetic tree based on COI gene and calculated the genetic distances稿件运行过程收稿日期：2023-10-21修回日期：2023-12-04关键词：琴蛙属；桂北琴蛙；新纪录；湖南省Key words：Nidirana；Nidirana guibeiensis；New record；Hunan Province中图分类号：Q958.1文献标识码：A文章编号：2310-1490（2024）-02-0448-08DOI：10.12375/ysdwxb.20240227基金项目：国家自然科学基金项目（31960099，32260136）；贵州省科技计划项目（黔科合基础-ZK 2022 一般540）；贵州省林业科研课题项目（黔林科合 2020 13号）；茅台学院高层次人才科研启动经费项目（mygccrc 2022 055，mygccrc 2022 067）第一作者简介：程彦林（1987），女，副教授；主要从事生物多样性保护研究。E-mail：*通信作者：李仕泽，E-mail：程彦林等：湖南省两栖动物新纪录桂北琴蛙第2期between species of the genus Nidirana used Kimura 2-parameter model.The phylogenetic tree showed that the specimens from Hunan were clustered with the N.guibeiensis with a high support（1.00/99）.The genetic distance between the specimens from Hunan and N.guibeiensis from type locality was 0，which was much lower than that between Nidirana species range from 2.7%to 14.4%.Based on morphological and molecular comparisons，the specimens were identified as N.guibeiensis，which is a new record of Hunan Province，China.琴蛙属（Nidirana）广泛分布于东亚和东南亚的亚热带地区，目前该属物种已报道20种1，中国记录分布有19种，其中，湖南省记录分布有4种，分别为弹琴蛙（N.adenopleura）、粤琴蛙（N.guangdongensis）、雷山琴蛙（N.leishanensis）和湘琴蛙（N.xiangica）26。弹琴蛙曾被记录在湖南广泛分布5，近年来基于整合分类学研究，琴蛙属内有多个隐存种被发现，且这些隐存种之前大多被误定为弹琴蛙，因此，弹琴蛙在湖南是否有分布还有待进一步研究6；粤琴蛙分布在湖南东南部八面山等地2；雷山琴蛙分布在湖南西部怀化、通道等地3；湘琴蛙分布在湖南湘江流域、湖南浏阳大围山和双牌阳明山等地2。2023年5月26日，在新宁县崀山镇进行两栖动物调查时，于坪地村（261940 N，1104254 E；海拔441 m）采集到4号（4）琴蛙属成体标本。经形态学比较和系统发育分析，鉴定为桂北琴蛙（N.guibeiensis），为湖南省两栖动物新纪录种。本文对桂北琴蛙的形态特征及生态习性进行描述，并初步探讨其形态特征的地理变异，为琴蛙属物种的系统学和谱系地理学研究提供新信息。1材料与方法1.1材料对采集的标本取少量肌肉组织存于95%的乙醇中用于提取DNA。标本浸泡于10%福尔马林溶液中，保存于茅台学院生物学标本室。本研究采集的4号标本及用于系统发育分析的部分琴蛙属物种信息见表1。1.2形态鉴定与测量使用游标卡尺（无锡锡工量具有限公司，量程200 mm，精度 0.01 mm）测量 4号标本的头体长、头长和头宽等17项形态指标，并参照 中国两栖动物检索及图解7、中国两栖动物及其分布彩色图鉴8和桂北琴蛙形态描述9进行形态鉴定。1.3分子鉴定以高盐法提取保存于乙醇中的肌肉组织DNA。参照Che等10引物序列扩增COI基因部分片段并测序，选用引物 Chmf4：5-TYTCWACWAAYCAYAAA-GAYATCGG-3和Chmr4：5-ACYTCRGGRT-GRCCR-AARAATCA-3。PCR反应扩增体系为2.50 L 10Buffer，2.00 L dNTP，0.25 L Taq酶，上、下游引物各 1.00 L，DNA 模板 1.00 L，最后加入 17.25 L灭菌超纯水补足至终体积25.00 L。PCR扩增反应程序：95 预变性 4 min；94 变性 40 s，48 退火40 s，72 延伸 60 s，共 35 个循环；最后 72 延伸 10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测大小和纯度，大小符合要求的产物交生工生物工程（上海）股份有限公司测序。所得序列上传到GenBank，登录号为OR979474OR979477。在GenBank中下载琴蛙属部分物种和近缘类群拇棘蛙属（Babina）物种的 COI基因，结合本次采集标本所测序列进行系统发育分析。以琉球拇棘蛙（Babina holsti）和奄美拇棘蛙（Babina subaspera）为外群9。所有序列在软件Clustal X v1.8中比对11，采用贝叶斯法（Bayesian inference of phylogeny，BI）和最大似然法（maximum likelihood，ML）重建系统发育关系。建树前，利用软件 jModelTest v2基于 AIC 标准选择最佳核苷酸替代模型12。最大似然树（ML）在软件 PhyML v 3.0 中完成13，并进行 1 000 次 bootstrap 重 抽 样 分 析，检 验 各 节 点 置 信 度。采 用MrBayes 3.2.4软件进行贝叶斯分析14，以随机树为起始树，在默认热值条件下同时运行4条马尔可夫链，运行1107代。每隔1 000代抽样一次，舍弃25%的老化树。使用Figtree软件查看结果并获得系统树的支系结构和各支系的后检验概率。最后用MEGA v6.0中的Kimura双参数模型15计算表1中所列琴蛙属物种间的遗传距离。449野 生 动 物 学 报第45卷2结果2.1形态描述本次采集的4号标本均为雄性个体（XN20230526021XN20230526024），头体长 50.3856.15 mm，其他部位量度见表2。标本吻端钝圆，头长和头宽几乎相等，瞳孔横置，鼓膜明显，大而圆，边缘略突出，舌后端有明显缺刻，犁骨齿发达；前臂较粗，手指纤细，指端略微膨大，指长序，掌突2个，呈椭圆形，指关节下瘤明显；左右跟部重叠明显，胫跗关节贴体前伸达眼鼻之间，趾长序V，趾端有腹侧沟，趾间具2/3蹼，蹼式为I2-21-3-2-3+3+-2-V，趾关节下瘤明显，第趾上有3个，第、V趾上有2个，第、趾上有1个；内蹠突呈长条状，外蹠突椭圆；背部浅棕色，体侧淡黄色；背部及体侧有黑色斑；背中线明显，呈棕色，四肢棕黄色；鼓膜棕褐色；颌腺和肩腺均为乳白色；腹部光滑，四肢及咽部肉色，腹部白色；具1对内声囊，第指具婚垫（图1）。表1本研究使用的样品采集信息、标本号和GenBank登录号Tab.1 Sample collection information，specimen number and GenBank accession number of this study物种Species本研究标本 Specimens for this study弹琴蛙 Nidirana adenopleura沙巴琴蛙 Nidirana chapaensis重庆琴蛙 Nidirana chongqingensis仙琴蛙 Nidirana daunchina粤琴蛙 Nidirana guangdongensis广西琴蛙Nidirana guangxiensis桂北琴蛙Nidirana guibeiensis海南琴蛙 Nidirana hainanensis雷山琴蛙 Nidirana leishanensis林琴蛙 Nidirana lini孟闻琴蛙 Nidirana mangveni南昆山琴蛙 Nidirana nankunensis滇西琴蛙 Nidirana occidentalis琉球琴蛙 Nidirana okinavana滇蛙 Nidirana pleuraden十万大山琴蛙 Nidirana shiwandashanensis湘琴蛙 Nidirana xiangica瑶琴蛙 Nidirana yaoica叶氏琴蛙 Nidirana yeae琉球拇棘蛙 Babina holsti奄美拇棘蛙 Babina subaspera标本号Specimen No.XN20230526021XN20230526022XN20230526023XN20230526024SYS a007358MNHN 2000.4850SWU0001408SYS a004594SYS a005767NHMG 202007001NNU 00917SYS a007669SYS a007908SYS a003967SYS a006310SYS a005718SYS a003775SYS a007858NNU00238SYS a006491SYS a007020CIB TZ20190608005采集地Collection locality湖南新宁 Xinning Hunan台湾台中 Taichung Taiwan越南老街 Lao Cai Vietnam重庆黔江 Qianjiang Chongqing四川峨眉山 Mt.Emei Sichuan广东英德 Yingde Guangdong广西大明山 Mt.Daming Guangxi广西兴安 Xing an Guangxi海南陵水 Lingshui Hainan贵州雷公山 Mt.Leigong Guizhou云南江城 Jiangcheng Yunnan浙江大盘山 Mt.Dapan Zhejiang广东南昆山 Mt.Nankun Guangdong云南高黎贡山 Mt.Gaoligong Yunnan日本冲绳 Okinawa Japan云南昆明 Kunming Yunnan广西上思 Shangsi Guangxi湖南大围山 Mt.Dawei Hunan广西大瑶山 Mt.Dayao Guangxi贵州桐梓 Tongzi Guizhou日本冲绳 Okinawa Japan日本鹿儿岛 Kagoshima JapanCOI GenBank登录号COI of GenBank accession numberOR979474OR979475OR979476OR979477MN945201KR087625OQ843905MF807861MN945162MZ678729ON968962MN945207MN945209MF807857MN945180MF807878MF807855NC022872MT932858MZ782098MN945189MK895041MN295234NC022870NC022871450程彦林等：湖南省两栖动物新纪录桂北琴蛙第2期表2桂北琴蛙成体标本形态量度对比Tab.2 Morphometric comparisons of adult specimens of Nidirana guibeiensismm形态量度Morphometric measurements头体长 Snout-vent length头长Head length头宽 Head width吻长 Snout length鼻间距 Internasal space眼径 Diameter of eye眼间距 Interorbital space上眼睑宽 Width of upper eyelid鼓膜径 Diameter of tympanum前臂及手长 Length of lower arm and hand前臂宽 Width of lower arm后肢长 Hindlimb length股长 Thigh length胫长 Tibia length胫宽 Tibia width跗足长 Length of foot and tarsus足长 Foot length广西兴安（，n=139）Xing an in Guangxi范围值Range50.263.618.622.518.323.17.09.55.36.64.46.94.15.64.66.325.729.926.233.4平均值标准差MeanSD55.23.719.91.120.11.47.50.76.00.55.60.74.90.45.40.528.41.529.32.0湖南新宁（，n=4）Xinning in Hunan范围值Range50.3856.1516.5218.1816.4218.455.637.555.325.694.636.423.534.893.203.913.905.0021.6424.403.093.6380.5390.9322.3926.5623.1929.376.487.7537.7341.3324.0627.67平均值标准差MeanSD53.242.4017.350.5917.620.876.970.785.530.175.500.784.490.553.500.334.480.4322.791.093.410.2283.984.1224.071.7326.352.427.010.5039.821.5326.411.39A.侧面观；B.腹面观；C.手背面观；D.手腹面观；E.脚腹面观。A.Lateral view；B.Ventral view；C.Dorsal view of hand；D.Ventral view of hand；E.Ventral view of foot.图1桂北琴蛙（）形态学特征（湖南新宁）Fig.1 Morphological characteristics of Nidirana guibeiensis（Xinning County，Hunan Province）451野 生 动 物 学 报第45卷2.2系统发育关系和遗传距离PCR扩增获得的琴蛙线粒体COI基因片段长度为672 bp。在jModelTest v2软件中基于AIC标准计算了最佳核苷酸替代模型，本文用于系统发育分析的最佳核苷酸替代模型为GTR+G+I。基于贝叶斯法和最大似然法构建系统发育树（图2）显示，采自湖南新宁的琴蛙标本与桂北琴蛙模式产地（广西兴安）的标本聚为一支，且有较高的支持率（1.00/99）。基于Kimura双参数模型估算本研究所采琴蛙属部分物种的遗传距离为2.7%14.4%（表3），平均遗传距离为7.5%。本研究所采集的琴蛙标本与桂北琴蛙模式产地（广西兴安）标本间的遗传距离为0，说明两个种群间共享同一单倍型，未出现遗传分化。通过形态比较，在新宁采集的琴蛙标本与桂北琴蛙原始文献8的描述吻合，系统发育分析也支持采自湖南新宁的琴蛙标本与桂北琴蛙模式产地标本聚为一支。因此，综合形态比较与分子系统学分析，鉴定采集于湖南新宁崀山镇的琴蛙标本为桂北琴蛙，为湖南省两栖动物分布新纪录。图中数字代表重抽样支持率，前者为贝叶斯法支持率，后者为最大似然法支持率。XN20230526021XN20230526024为本研究采集的标本号，其余物种序列信息见表1。The figures represent resampling support rates（BI/ML）.XN20230526021-XN20230526024 are the specimen number collected in this study，and the sequence information of other species are shown in table 1.图2基于COI基因序列构建的琴蛙属部分物种贝叶斯和最大似然法系统发育树Fig.2 Bayesian inference and maximum likelihood phylogenetic tree of some species of Nidirana based on COI gene sequences452程彦林等：湖南省两栖动物新纪录桂北琴蛙第2期表3基于COI基因序列估算的琴蛙属物种间Kimura双参数遗传距离Tab.3 Estimation of Kimura 2-parameter genetic distance among Nidirana species based on COI gene sequences物种Species1.桂北琴蛙（广西兴安）Nidirana guibeiensis（Xing an，Guangxi）2.桂北琴蛙（湖南新宁）Nidirana guibeiensis（Xinning，Hunan）3.湘琴蛙 Nidirana xiangica4.雷山琴蛙 Nidirana leishanensis5.沙巴琴蛙 Nidirana chapaensis6.瑶琴蛙 Nidirana yaoica7.叶氏琴蛙 Nidirana yeae8.粤琴蛙 Nidirana guangdongensis9.重庆琴蛙 Nidirana chongqingensis10.海南琴蛙 Nidirana hainanensis11.仙琴蛙 Nidirana daunchina12.十万大山琴蛙 Nidirana shiwandashanensis13.广西琴蛙 Nidirana guangxiensis14.弹琴蛙 Nidirana adenopleura15.南昆山琴蛙 Nidirana nankunensis16.林琴蛙 Nidirana lini17.琉球琴蛙 Nidirana okinavana18.孟闻琴蛙 Nidirana mangveni19.滇西琴蛙 Nidirana occidentalis20.滇蛙 Nidirana pleuraden100.0270.0270.0550.0550.0550.0570.0590.0600.0620.0640.0590.0910.0980.1010.1010.1010.1280.14420.0270.0270.0550.0550.0550.0570.0590.0600.0620.0640.0590.0910.0980.1010.1010.1010.1280.14430.0280.0520.0550.0550.0620.0590.0550.0620.0710.0590.1070.1000.1070.1090.1070.1260.14140.0550.0550.0590.0620.0550.0550.0620.0600.0550.0960.0980.1100.1070.1070.1320.14450.0280.0300.0600.0320.0430.0480.0430.0340.0820.0960.0850.0850.0930.1100.12560.0230.0530.0250.0430.0370.0390.0300.0750.1000.0960.0890.0910.1170.12370.0520.0340.0440.0390.0270.0180.0820.0960.0850.0890.0940.1210.11780.0640.0570.0590.0680.0660.0890.0910.0960.0930.0980.1260.11690.0430.0480.0390.0410.0890.1000.0940.1010.0980.1230.128100.0530.0530.0520.0840.1050.0940.0940.0940.1170.119110.0480.0430.0890.1090.0930.0940.0960.1120.121120.0270.0910.1120.0960.0960.1030.1140.119130.0850.1030.0960.0890.1000.1250.128140.0710.0960.0460.0480.1120.109150.0930.0710.0690.1250.116160.1030.0980.1140.110170.0480.1140.110180.1120.126190.085453野 生 动 物 学 报第45卷2.3生境描述本次桂北琴蛙标本的采集地位于湖南省新宁县崀山镇坪地村海拔441 m的农田附近，发现时雄蛙正在鸣叫（图3）。与其同域分布的两栖类还有中华湍 蛙（Amolops sinensis）、阔 褶 水 蛙（Hylarana latouchii）、泽陆蛙（Fejervarya multistriata）、三港雨蛙（Hyla sanchiangensis）、斑 腿 泛 树 蛙（Polypedates megacephalus）和饰纹姬蛙（Microhyla fissipes）等。3讨论琴蛙属物种在中国南方广泛分布，大多数物种间形态较为相似，因此据形态特征很难对其进行鉴定8。近年来，随着分子生物学的发展，采用形态比较结合分子系统学分析对物种进行鉴定的方法已被广泛应用。本研究通过下载已有报道的琴蛙属部分物种的COI序列，构建系统发育树，计算遗传距离，发现本研究所采标本和湖南省记录分布的弹琴蛙、湘琴蛙、粤琴蛙和雷山琴蛙的遗传距离分别为9.1%、2.7%、5.7%和2.7%，和模式产地（广西兴安）的桂北琴蛙遗传距离为0，远小于其他琴蛙属的遗传距离。采自湖南新宁的琴蛙标本与湖南已记载的4种琴蛙属物种在形态上存在一定差异23，5，9。桂北琴蛙头长与头宽几乎相等，区别于湘琴蛙、粤琴蛙和雷山琴蛙的头长大于头宽；无雄性线，区别于弹琴蛙的有雄性线；掌突2个，区别于弹琴蛙、湘琴蛙、粤琴蛙和雷山琴蛙的 3 个掌突；有弱的颞褶，区别于弹琴蛙、湘琴蛙、粤琴蛙和雷山琴蛙的无颞褶。本次采集的桂北琴蛙和模式产地（广西兴安）标本在形态上也存在一些差异，新宁桂北琴蛙后肢贴体前伸达眼中部，不同于模式产地桂北琴蛙的达鼻眼之间。但由于本次所采桂北琴蛙样本数量有限，上述差异是否为适应不同环境而导致的形态变异，还有待进一步论证。桂北琴蛙为 2022 年新发表的两栖动物新物 种，此前在我国仅分布于广西兴安县和猫儿山国家级自然保护区，栖息在海拔3001 300 m的稻田、静水塘旁9。此次在湖南省新宁县崀山镇坪上村（海拔441 m）发现桂北琴蛙，不仅丰富了其分布信息，也将桂北琴蛙的分布区域向北扩展至湖南中南部。结合已有的报道，本研究推测桂北琴蛙可能沿资江流域分布，因此，建议在该区域进行全面详细地调查，以了解桂北琴蛙确切的分布范围及种群状况。参考文献：1 FROST D R.Amphibian species of the world：an online reference：version 6.0 DB/OL.2023-09-20.https：/amphibiansoftheworld.amnh.org/.2 LYU Z T，DAI K Y，LI Y，et al.Comprehensive approaches reveal three cryptic species of genus Nidirana（Anura，Ranidae）from China J.ZooKeys，2020，914：127-159.图3湖南新宁桂北琴蛙生境Fig.3 Habitat of Nidirana guibeiensis in the Xinning County，Hunan Provine454程彦林等：湖南省两栖动物新纪录桂北琴蛙第2期3 刘京，程彦林，周铝，等.湖南通道发现雷山琴蛙 J.动物学杂志，2022，57（1）：105-111.LIU J，CHENG Y L，ZHOU L，et al.Nidirana leishanensis found in Tongdao，HunanJ.Chinese Journal of Zoology，2022，57（1）：105-111.4 中国科学院昆明动物研究所.“中国两栖类”信息系统 DB/OL.2023-09-20.http：/www.amphibiachina.org/.Kunming Institute of Zoology.The database of Chinese amphibianDB/OL.2023-09-20.http：/www.amphibiachina.org/.5 沈猷慧，杨道德，莫小阳，等.湖南动物志：两栖纲 M.长沙：湖南科学技术出版社，2014：236-240.SHEN Y H，YANG D D，MO X Y，et al.Fauna Hunan：AmphibiaM.Changsha：Hunan Science and Technology Press，2014：236-240.6 高志伟，钱天宇，江建平，等.湖南省两栖、爬行动物物种多样性及其地理分布 J.生物多样性，2022，30（2）：97-111.GAO Z W，QIAN T Y，JIANG J P，et al.Species diversity and distribution of amphibians and reptiles in Hunan Province，ChinaJ.Biodiversity Science，2022，30（2）：97-111.7 费梁，叶昌媛，黄永昭，等.中国两栖动物检索及图解 M.成都：四川科学技术出版社，2005：6-13；119-121.FEI L，YE C Y，HUANG Y Z，et al.An illustrated key to Chinese amphibians M.Chengdu：Sichuan Publishing House of Science and Technology，2005：6-13；119-121.8 费梁，叶昌媛，江建平.中国两栖动物及其分布彩色图鉴M.成都：四川科学技术出版社，2012：344-345.FEI L，YE C Y，JIANG J P.Colored atlas of Chinese amphibians and their distributions M.Chengdu：Sichuan Publishing House of Science&Technology，2012：344-345.9 CHEN W C，YE J P，PENG W X，et al.A new species of Nidirana（Anura，Ranidae）from northern Guangxi，China J.ZooKeys，2022，1135：119-137.10 CHE J，CHEN H M，YANG J X，et al.Universal COI primers for DNA barcoding amphibiansJ.Molecular Ecology Resources，2012，12（2）：247-258.11 THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al.The CLUSTAL_X windows interface：flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis toolsJ.Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4882.12 POSADA D.jModelTest：phylogenetic model averaging J.Molecular Biology and Evolution，2008，25（7）：1253-1256.13 GUINDON S，DUFAYARD J F，LEFORT V，et al.New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies：assessing the performance of PhyML 3.0 J.Systematic Biology，2010，59（3）：307-321.14 RONQUIST F，HUELSENBECK J P.MrBayes 3：Bayesian phylogenetic inference under mixed modelsJ.Bioinformatics，2003，19（12）：1572-1574.15 TAMURA K，STECHER G，PETERSON D，et al.MEGA6：molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 J.Molecular Biology and Evolution，2013，30（12）：2725-2729.455