药用辅料乳糖中痕量亚硝酸盐和硝酸盐的离子色谱-电导_紫外检测研究.pdf

药学与临床研究药学PharmaceuticalandClinical Research研究药用辅料乳糖中痕量亚硝酸盐和硝酸盐的离子色谱-电导/紫外检测研究朱林12,陈鑫茹1.3,施海蔚12,周小华1.2,袁耀佐1-2,朱晓玥1.2*1江苏省食品药品监督检验研究院，南京2 10 0 19；2 国家局化学药品杂质谱研究重点实验室，南京2 10 0 19；3中国药科大学药学院，南京2 10 0 0 9摘要目的：建立药用辅料乳糖中痕量亚硝酸盐、硝酸盐的离子色谱-抑制电导(IC-CD)检测法和高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)检测法。搭建在线膜抑制系统，结合LC-MS/MS技术进行结构确证，为药用辅料乳糖的前置风险控制提供新的策略。方法：IC-CD检测法和HPLC-UV检测法均采用高容量阴离子交换柱DionexIonPacTM AS11-HCRFICTM(4.0mm250mm）和保护柱DionexIonPacTM AS11-HC RFICTM(4.0mm50mm)。IC-CD 检测法流动相为氢氧化钾溶液,梯度洗脱，抑制型电导检测器的电导池温度为30;HPLC-UV检测法流动相为5mmolL-1氢氧化钠溶液，检测波长为2 10 nm；两种方法的流速均为1.0 mLmin-1,柱温均为30,进样量均为25L。结果：两种方法测定亚硝酸根在0.0 3 10 gmL-1范围内、硝酸根在0.0 2 2 0 0 gmL-1范围内线性关系均为良好(r0.999)；亚硝酸根检测限和定量限分别为0.2 5ng和0.7 5ng，硝酸根检测限和定量限分别为0.2 5ng和0.50 ng；回收率在8 4.0 0%10 0.7 0%之间；进样精密度RSD（n=6)在0.27%1.33%之间；均满足检验需求。结论：两种方法均具有灵敏度高、专属性强、分离度好、前处理简单的优势，可表征药用辅料乳糖中痕量亚硝酸盐、硝酸盐的含量，也为其他药用辅料前置风险研究提供新的思路和参考。关键词乳糖；药用辅料；亚硝酸盐；硝酸盐；离子色谱-抑制电导检测法；高效液相色谱-紫外检测法中图分类号R927.11文献标志码A文章编号16 7 3-7 8 0 6(2 0 2 4)0 2-115-0 7杂质是引起药品不良反应的重要因素，而基因毒性杂质（genotoxic impurities,GTIs)的危害更为严重。N-亚硝胺类是公认基因毒性杂质叫，由亚硝化试剂(亚硝酸盐、硝酸盐、氮氧化物等)与生物胺通过亚硝化反应生成2 。近年来药物中亚硝胺类有关杂质（nitrosamine drug substance-related impuri-ties,NDSRI）倍受全球药品监管机构和医药企业关注，由原料药中胺源通过与赋形剂中存在的微量亚硝酸盐发生反应形成3,这一影响在二甲双胍的质量研究中也得到验证4。BOETZELR等5 建立的亚硝酸盐辅料数据库也表明,用作稀释或填充作用的赋形剂是构成药品的主要成分，也是固体剂型中亚*基金项目2023年国家药品评价性抽验资助（国药监药管2 0 2 3J2号）作者简介朱林，女，助理工程师E-mail：118 6 917 7 6 3 q q.c o m陈鑫茹,女，在读硕士E-mail:（朱林和陈鑫茹为共同第一作者）*通信作者朱晓玥，女，副主任药师E-mail:114549361?收稿日期2023-12-25修回日期2 0 2 4-0 3-0 4硝酸盐的主要来源。药用辅料不同于药物，一种辅料可以应用于多种药物的生产,某一种辅料的安全存在问题必然导致多种药品出现安全性问题。针对药物中亚硝胺类有关杂质，开发适宜的检测方法，在源头把控药用辅料质量，前置风险控制十分必要。亚硝酸盐和硝酸盐的常见检测技术手段包括滴定法、比色法、紫外分光光度法、电化学法、荧光光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、离子色谱法等。其中滴定法和比色法操作繁、误差大；紫外分光光度法受样品自身色素干扰、影响结果真实性电化学法操作技术要求高、重现性不佳；荧光法灵敏度低、大多需要依托合成复杂纳米材质来提高其灵敏度；气相色谱法需衍生化，且操作过程复杂，费时费力9。而离子色谱法和高效液相色谱法具有专属性强、灵敏度高、分析速度快等特点被广泛应用10.1本研究以应用广泛的药用辅料乳糖为研究对1152024Apr;32(2)药用辅料乳糖中痕量亚硝酸盐和硝酸盐的离子色谱一电导/紫外检测研究象，选择高效液相色谱检测技术，分别建立了离子色谱-抑制电导(IC-CD)检测法和高效液相色谱-紫外(HPLC-UV)检测法测定药用辅料乳糖中痕量的亚硝酸盐和硝酸盐，并为类似的药用辅料质量控制提供参考。本研究还利用阴离子动态再生抑制器可在外接水模式下在线除盐的特点，巧妙搭建在线膜抑制系统,结合LC-MS/MS液质联用技术对所建方法进行结构确证。经方法学验证，两套方法灵敏度高、专属性强、分离度好、前处理简单，可用于药用辅料乳糖中痕量亚硝酸盐和硝酸盐的检测，为乳糖的质量标准提高和药品监管提供一定的数据支撑；助力企业产品的质量内控、实现快速筛检，也为N-亚硝胺杂质的前置风险控制研究提供新的思路和策略。1材料1.1仪器Dionex ICS-5000+离子色谱仪、Dionex ICS-5000+电导检测器均购自美国ThermoFisher Scien-tific公司;LC-20AB高效液相色谱仪、SPA-20A紫外检测器均购自日本岛津科技有限公司；SCIEXQTRAPTM6500+LC-MS/MS液质联用仪（上海爱博才思分析仪器贸易有限公司）;Milli-Q?IQ7000超纯水系统西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;XSE205DU型电子天平（瑞士梅特勒托利多科技有限公司）。1.2试药超纯水;氢氧化钾溶液（Dionex EGC 500 KOH氢氧化钾淋洗液发生罐，Thermo Fisher Scientific公司）；氢氧化钠水溶液（Sigma-Aldrich,分析级，含量：49.4%）。药用辅料乳糖为2 0 2 3年国家评价性抽验样品，对各厂家随机抽取共16 批次样品，1.3标准物质氟单元素标准溶液（GSB04-1771-2004）、氯单元素标准溶液（GSB04-1770-2004）硫酸根单元素标准溶液GSB 04-1773-2004(a)、亚硝酸根单元素标准溶液（GSB04-2839-2011）硝酸根单元素标准溶液（GSB04-1772-2004)均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；磷酸根单元素标准溶液GBW(E)083220购自北京北方伟业计量技术研究院。以上溶液标准值均为10 0 0 gmL-l。2方法与结果2.1溶液的制备2.1.1对照品溶液分别精密量取亚硝酸根、硝酸116根单元素标准溶液1.0 mL，加水适量配制成浓度为2gmL-1的亚硝酸盐对照品溶液及硝酸盐对照品溶液。2.1.2供试品溶液取乳糖约1.0 g，精密称定，置10mL量瓶中,加水适量使其溶解并稀释至刻度,摇匀,用0.45m微孔滤膜滤过,取续滤液，即得。2.1.3系统适用性溶液IC-CD检测法：分别精密量取氟、氯、亚硝酸根、硝酸根、硫酸根、磷酸根单元素标准溶液各1.0 mL，加水适量，配制成各浓度分别为2.0 gmL-的混合溶液，作为系统适用性溶液。HPLC-UV检测法：分别精密量取亚硝酸根、硝酸根单元素标准溶液各1.0 mL，加水适量，配制成各浓度分别为2.0 gmL-1的混合溶液，作为系统适用性溶液。2.2色谱和质谱条件2.2.1色谱条件IC-CD检测法：色谱柱为DionexIonPacTMAS11-HC RFICT(4.0mm250mm);保护柱为 Dionex IonPacTM AS11-HCR FICTM（4.0 mm 50mm);抑制器:DionexASRS?300(4mm);柱温：30；流动相：氢氧化钾溶液（淋洗液发生器产生），梯度洗脱:0 2 0 min(5 mmol L-l)25.1 30 min(50 mmolL-)一30.1 40 min(5 mmolL-)，流速1.0mLmin*；进样体积：2 5L；电导检测器池温：30。HPLC-UV检测法：色谱柱、保护柱、柱温、流速、进样体积均同IC-CD检测法,检测波长:2 10 nm,流动相：5mmolL-1氢氧化钠溶液，运行时间：2 0 min。2.2.2质谱条件离子化方式：ESI(-)；扫描形式：多反应监测（MRM)模式；运行时间：40 min；循环次数：40 33；循环时间：0.5950 s；喷雾电压：450 0.0 V；干燥气：N2；离子源气体1:35.0 Lmin；离子源气体2：55.0Lmin*柱温：30；流速：0.5mLmin*;外接抑制器泵流速：1.2 mLmin；碰撞能等参数详见表1。表1MRM质谱参数母离子子离子驴驻留时间去簇电压石碰撞电压名称(m/z）)亚硝酸根46.00亚硝酸根46.00硝酸根62.00硝酸根62.00硝酸根62.002.3方法学验证2.3.1离子色谱一抑制电导检测法2.3.1.1专属性实验取空白溶剂（水）、系统适用性溶液、供试品溶液各2 5L,按“2.2.1 项下的色谱(mlz)46.0032.0062.0046.0032.00(ms)80.080.080.080.080.0(V)-45-45-45-45-45(V)-10-35-10-27-29药学与临床研究药学Pharmaceutical and Clinical Research研究条件进样测定，记录色谱图（图1)。结果表明（表2）,该色谱条件下,系统适用性溶液中氟离子、氯离子、亚硝酸根、硝酸根、硫酸根和磷酸根色谱峰分离度良好，峰型俱佳。在供试品溶液中也具有良好的分离效果,空白溶剂对亚硝酸根、硝酸根的测定均无干扰。由此说明，该方法专属性良好。5.74(sr）32100图1亚硝酸根和硝酸根的IC-CD色谱图(A)空白溶剂;(B)定量限溶液;(C)系统适用性溶液;(D)供试品溶液；1:氟离子；2：氯离子；3：亚硝酸根；4:硝酸根；5:硫酸根；6:磷酸根。表2 系统适用性溶液实验结果保留时间离子名称分离度对称因子理论塔板数(min)氟离子4.177氯离子9.863亚硝酸根12.187硝酸根23.967硫酸根28.600磷酸根29.2132.3.1.2线性实验精密量取亚硝酸根单元素标准溶液适量，用水稀释制成浓度分别为0.0 3、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 gmL-1的系列溶液，作为亚硝酸盐系列对照品溶液；精密量取硝酸根单元素标准溶液适量，用水稀释制成浓度分别为0.0 2、0.1、5.0、10.0、50.0、10 0.0、2 0 0.0 gmL-l的系列溶液，作为硝酸盐系列对照品溶液。按“2.2.1 项下的色谱条件分别进样，记录色谱图,以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归,亚硝酸根线性方程为Y=0.2684X+0.0033（r=0.9998），在0.0310.0g?mL-范围内线性关系良好；硝酸根线性方程为Y=0.1956X+0.0274(r=1.0000),在0.0 2 200.0gmL-范围内线性关系良好。2.3.1.3检测限与定量限分别量取亚硝酸根和硝酸根单元素标准溶液适量，用水逐步稀释，制备系列浓度溶液,进样分析，按信噪比(S/N)约为3和约为10,分别确定亚硝酸根和硝酸根的检测限和定量限（表3），定量限色谱图见图1。2.3.1.4溶液稳定性取一批乳糖样品约1.0 g，精密称定，置于10 mL量瓶中，精密加人2 0 gmL-1表3亚硝酸盐、硝酸盐检测限与定量限定量限相当于供试检测限相当于供试离子名称(ng)亚硝酸根0.75硝酸根0.50亚硝酸根对照品溶液1.0 mL，加水适量使样品溶解并稀释至刻度，摇匀，室温放置，分别于0、2、4、6、8、14、2 1、2 4h 进样1次,记录色谱图,计算亚硝酸根、D硝酸根峰面积。结果显示,乳糖中亚硝酸根、硝酸根峰面积的RSD分别为1.33%(n=8)、0.91%(n=8)，C表明供试品溶液在室温条件下2 4h内稳定性良好。BAT510品限度（%）310-5210-52.3.1.5进样精密度取亚硝酸根对照品溶液1520t/min20.05.316.48.64.5N/A(ng)0.250.252530351.4084161.12103741.11101441.08100960.979356021.09560723品限度（%）110-5110-540(2.0gmL-），按“2.2.1 项下的色谱条件进样测定，连续进样6 次，计算峰面积的RSD为0.2 7%（n=6），表明该仪器精密度良好。2.3.1.6回收率实验取已知亚硝酸根、硝酸根含量的样品1.0 g，置10 mL量瓶中，平行9份，分别精密加人混合对照品贮备液（含亚硝酸根2.0 gmL-l硝酸根10 0.0 gmL-)0.5、1.0、1.5mL，加水稀释至刻度，摇匀，配制成低（50%）、中（10 0%）、高（150%）3种不同浓度的供试品溶液各3份；按“2.2.1 项下的色谱条件进样测定，采用标准曲线法计算加样回收率，结果见表4。表4亚硝酸根、硝酸根加样回收率结果（n=9）本底值加人量测得量回收率平均值1RSD离子名称(gmL-)(gmL-)(gmL-)0.100.090.100.090.100.090.200.17亚硝酸根0.200.200.300.300.300.045.000.045.000.045.000.0410.00硝酸根0.040.040.040.040.04注：“表示未检出。2.3.2高效液相色谱一紫外检测法2.3.2.1专属性实验取空白溶剂（水）、系统适用117(%）87.8888.2888.150.2688.2885.270.1785.4785.410.140.1785.470.2584.000.2584.1484.000.160.2583.874.9598.994.9999.7999.450.414.9899.579.6396.3010.009.7310.009.5615.0014.4015.0014.3515.0014.43(%）(%）97.3396.410.9195.5996.0395.6895.970.2796.192024Apr;32(2)药用辅料乳糖中痕量亚硝酸盐和硝酸盐的离子色谱一电导/紫外检测研究性溶液、供试品溶液各2 5L，按“2.2.1项下的色谱条件进样测定，记录色谱图（图2）。结果显示（表5），该色谱条件下，系统适用性溶液中亚硝酸根、硝酸根色谱峰分离度良好，峰型俱佳。在供试品溶液中也具有良好的分离效果，空白溶剂对亚硝酸根、硝酸根的测定均无干扰，方法专属性良好。100 000180 00060 0004000020000002468101214161820t/min图2亚硝酸根和硝酸根的HPLC-UV色谱图(A)空白溶剂;(B)定量限溶液;(C)系统适用性溶液;(D）供试品溶液；1：亚硝酸根；2：硝酸根。表5系统适用性溶液实验结果离子名称保留时间（min）分离度对称因子王理论塔板数亚硝酸根8.779硝酸根16.5862.3.2.2线性实验亚硝酸盐系列对照品溶液、硝酸盐系列对照品溶液配制过程同“2.3.1.2 。按“2.2.1项下的色谱条件分别进样，记录色谱图，以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归,亚硝酸根线性方程为Y=14469X+7190（r=0.9999)，在0.0 310.0gmL-范围内线性关系良好；硝酸根线性方程为 Y=131 044X+187 645(r=0.999 9),在 0.0 2 200.0gmL-l范围内线性关系良好。2.3.2.3检测限与定量限分别量取亚硝酸根和硝酸根单元素标准溶液适量，用水逐步稀释，制备系列浓度溶液，进样分析，按S/N约为3和约为10,分别确定亚硝酸根和硝酸根检测限和定量限。测定结果同“2.3.1.3（表3），定量限色谱图见图2。2.3.2.4进样精密度取亚硝酸根对照品溶液(2.0 gmL-),按“2.2.1 项下色谱条件进样测定，连续进样6次，计算峰面积的RSD为1.33%(n=6),表明该仪器精密度良好。2.3.2.55回收率实验低（50%）、中（10 0%）高(150%）3种不同浓度的供试品溶液配制过程同“2.3.1.6。按“2.2.1项下色谱条件进样测定，采用标准曲线法计算加样回收率,结果见表6。2.4样品测定利用所建立的两种方法，分别对16 批国抽药用辅料乳糖样品进行测定，按照外标法计算乳糖中118表6 亚硝酸根、硝酸根加样回收率结果（n=9）本底值加人量测得量回收率平均值1RSD离子名称(ugmL-1)0.100.100.100.10亚硝酸根0.10D0.1010.10C0.10B0.10A0.800.80T0.800.80硝酸根0.800.800.800.80N/A1.0015.41.00(gmL-)(gmL-)(%）0.100.100.100.100.100.100.200.200.200.200.200.200.300.290.300.290.300.305.004.835.004.805.004.8010.0010.0510.0010.0710.0010.0915.0014.3515.0014.3399630.809953亚硝酸根、硝酸根的含量,结果见表7。IC-CD检测法中，16 批乳糖中均无亚硝酸根检出，硝酸根检出范围在4.410 4 6.2 910 mgg之间,RSD为83.94%;HPLC-UV检测法中，16 批乳糖中亚硝酸根检出范围在5.46 10 4 7.1310-mggl之间，硝酸根检出范围在7.6 10-9.0 2 10 mgg之间，RSD分别为7.53%、8 6.34%。结果表明，不同厂家、不同批次间乳糖中所含亚硝酸根、硝酸根差异较大。同时,亚硝酸根在HPLC-UV法中均有检出,且硝酸根检出量整体高于IC-CD检测法，说明HPLC-UV检测法灵敏度更优。2.5结构确证本研究使用LC-MS/MS液质联用仪结合在线膜抑制技术，即在分析柱后加装电导抑制器，通过阴离子交换膜在电压的作用下,将流动相中的钠离子去除，然后利用质谱检测，确认亚硝酸根和硝酸根的结构。示意图如图3。本研究利用QTRAP?LC-MS/MS技术中MRM模式，预先优化条件后，设定亚硝酸根、硝酸根的母离子及子离子的质荷比及碰撞能。液相色谱条件同HPLC-UV法，为保证柱后流动相中钠离子置换完全，流速调整为0.5mLminl,故2 10 nm波长下亚硝酸根和硝酸根出峰时间均约为原来2 倍。分别对空白溶剂、系统适用性溶液（即2.0 gmL-I的亚硝酸根、硝酸根混合对照品溶液）、乳糖供试品进行检（%）(%）96.2497.0796.660.4396.68100.5399.8297.5496.7397.3997.520.8998.4696.5896.0796.190.3695.92100.48100.74100.700.20100.8895.6795.5095.620.1115.0014.4399.291.5795.69药学与临床研究药学PharmaceuticalandClinical Research研究表7 乳糖中亚硝酸根、硝酸根测定结果亚硝酸根含量样品名称(x10mgagl)IC-CD法HPLC-UV法IC-CD法HPLC-UV法样品-15.46样品-26.07样品-35.71样品-45.97样品-56.95样品-66.16样品-76.84样品-87.13样品-95.94样品-106.73样品-116.62样品-126.72样品-136.61样品-146.06样品-156.62样品-166.62含量平均值(mgg)6.38RSD(%)7.53抑制器电源（外接）泵（外接）泵进样器色谱柱图3LC-MS液质联用仪结合在线膜抑制技术示意图601A50403020100-10010203040t/min(A)210nm波长色谱图；(B)m/z46.00提取离子流图；(C)m/z62.00提取离子流图。607A50-4020-100-10-010203040t/min(A)210nm波长色谱图；(B)m/z46.00提取离子流图；(C)m/z62.00提取离子流图。测,通过2 10 nm波长下各色谱峰的保留时间,结合硝酸根含量提取的离子流信息进行化合物确证。由于乳糖样品(10mgng)中亚硝酸根在UV检测器中最大检出0.0 7 gmL-1(1.75ng）,质谱在当前色谱条件下因背景噪音较高，1.372.071.712.581.742.360.440.930.500.766.299.021.001.21.1.221.801.212.080.450.902.821.393.503.132.311.631.161.991.031.801.281.981.752.2383.9486.34废液6质谱X1062.57B2.0亚硝酸根硝酸根RT:17.19RT:32.06RT:17.15RT:31.95无法检出样品中亚硝酸根，于是向样品中加人亚硝酸根标准溶液，使其在供试品溶液中浓度约为1gmL。结果表明（图4 5、表8），乳糖样品溶液中亚硝酸根和硝酸根出峰时间、m/z与混合对照品溶液中的一致。由此推定在样品中17.15min左右色谱峰为亚硝酸根，在31.95min左右色谱峰为硝酸根。3 讨 论3.1色谱柱的选择前期在高效液相色谱-电喷雾检测器(CAD)上使用两性离子色谱柱AcclaimTrinityP2进行乳糖探索性研究发现,乳糖中所含有的阴阳离子种类较多、离子极性差别较大、出峰复杂。乳糖样品中亚硝酸根最大检出0.0 2%，但经质谱确证，亚硝酸盐的检出量存在假阳性，说明两性离子色谱柱专属性不佳。同时，乳糖样品中所含阴离子不仅种类多而且含量低，需要较高的质量浓度。对比现有阴离子检测专用色谱柱，最终选择高容量阴离子交换柱Dionex IonPacM AS11-HC RFICM。该柱适用于高浓度样品中各种痕量无机阴离子和有机酸阴离子的分离，可以实现乳糖中6 种阴离子有效分离且不1082.01C1.5m/z46.001.5RT:17.1841.00.5-0.010图4系统适用性溶液1062.57B2.01.50.50.010图5加标供试品溶液m/z 46.00RT:17.181.00.50.01520t/minm/z46.00RT:17.151520t/min251082.01C1.51.00.50.0725252530t/minmlz62.00RT:31.973035t/min35407401192024Apr;32(2)药用辅料乳糖中痕量亚硝酸盐和硝酸盐的离子色谱-电导/紫外检测研究表8 混合对照品溶液和加标样品质谱检测结果离子流图中保留时间（min）M-H(m/z)离子名称混合对照品加标供试品 混合对照品加标供试品溶液溶液亚硝酸根17.18硝酸根32.09会出现过载和峰展宽的现象。该柱还可以耐受基质复杂的样品检测，无需复杂的前处理步骤，大大提高检测效率、降低费用。3.2流动相的选择选择相对于碳酸盐体系更稳定的氢氧根体系作为淋洗液，该体系可最大限度地减少梯度洗脱过程中的基线偏移，实现更佳的重现性、更低的背景噪音和更灵敏的检测限度。同时，该体系对样品中共同存在的强、弱组分均有良好的分离能力。3.3色谱条件优化由于乳糖实际样品中所含阴离子种类多、保留强度差别较大。IC-CD检测法利用淋洗液发生器进行梯度优化，实现各阴离子之间有效分离，分离度均不低于4.5。等度条件下硝酸根洗脱后，通过快速提高淋洗液浓度至50 mmolL-将样品中所有阴离子全部洗脱，在无残留干扰的情况下每一针运行40 min即可实现样品快速检验。整个洗脱流程均通过淋洗液自动发生器产生，避免了手动配制淋洗液导致亚硝酸盐和硝酸盐的峰漂移而造成的假阳性现象。3.4检测器选择离子色谱法是用于溶液中阴阳离子分析的经典方法，但离子色谱仪在普适性上存在一定的局限。本研究利用亚硝酸根、硝酸根紫外吸收特性,开发出HPLC-UV法。在实验室不具备离子色谱仪的条件下，仅需要购买一根离子色谱柱即可进行亚硝酸盐、硝酸盐的快速筛选,实现样品质量的控制。当前开发的两套方法经方法学验证和质谱确证，其专属性均为良好。HPLC-UV法作为检测亚硝酸根、硝酸根的新方法，具有更高的灵敏度优势，可为企业进行产品的质量内控、快速筛检提供参考。3.5样品测定结果分析利用两套方法对16 批乳糖进行检测，结果表明，不同厂家、不同批次之间乳糖中所含亚硝酸盐、硝酸盐水平差异较大，硝酸盐甚至跨越一个数量级。目前，还没有关于赋形剂中亚硝酸盐、硝酸盐含量的监管要求，这也是导致厂家之间甚至批次之间质量存在巨大差异的主要原因之一，以上结果可为药用辅料乳糖的质量标准提高和药品监管提供一定的数据支撑。1203.6质谱结果分析由于样品中亚硝酸盐含量极低，且分子量小于50。本研究利用LC-MS/MS 技术的高准确性、高选浴液溶液17.1546.0031.9762.00择性和高灵敏度的特点，对样品中亚硝酸根、硝酸46.00根进行确证。但研究发现当前色谱条件亚硝酸盐在62.00质谱中检测限为1gmL-1,显著劣于建立的IC-CD和HPLC-UV检测法。综合分析,可能由于在线膜抑制后进入质谱检测器的流动相中只有纯水，影响待测物质离子化，进而导致物质响应不佳。另一方面，由于高效液相色谱仪的金属管路不同于离子色谱仪的peak管路,氢氧根体系对金属管路存在一定的腐蚀作用，微量的系统流失，导致质谱背景噪音较大，进而导致检测灵敏度不佳，这是目前使用膜抑制技术并采用当前色谱条件在LC-MS/MS上检测亚硝酸盐和硝酸盐存在的局限之处。但在线膜抑制技术稳定性好，应用范围较广泛，可为柱后去除流动相中离子对或不挥发的阴阳离子实现质谱检测。4小结本研究建立了IC-CD和HPLC-UV测定药用辅料乳糖中痕量亚硝酸盐、硝酸盐的含量，并利用LC-MS/MS液质联用仪结合在线膜抑制技术对其结构进行确证。经验证，两套方法前处理简单、专属性强、分离度好、耐用性佳、重现性优，灵敏度可达到0.1ppm,均可用于表征药用辅料乳糖中痕量亚硝酸盐、硝酸盐的含量。尤其是HPLC-UV检测法,为企业的产品质量内控节约了成本，提供了新的思路和策略。赋形剂中亚硝化杂质对药品质量的重要性直到最近几年才被认识到。从风险评估角度来看，有必要呼吁药品生产企业和辅料生产企业之间加强合作，广泛研究赋形剂的生产途径，对易形成亚硝胺的赋形剂给予重点关注。在监控产品质量时，不仅仅依赖于药典对辅料的规范，还应该制定和实施更为严格的控制策略来控制亚硝胺杂质及其前体，使得整个行业能够更好且更为严格地控制各类辅料的质量安全。本研究所建立的两套方法可以为提高药用辅料乳糖的产品质量以及N-亚硝胺杂质的前置风险控制提供新的思路和参考，具有良好的实用性，也对其他药用辅料中痕量亚硝酸盐、硝酸盐的研究有一定的指导意义。参考文献1孔璇.药物中N-亚硝胺类基因毒性杂质检测方法的研究进展 天津药学，2 0 2 2,34(1):6 2-7.药学与临床研究药学Pharmaceutical and Clinical Research研究2KHAMIS AM,QIZI OMONOVA CT,MUGAKA BP.Short review on genotoxic impurities in sartans J.World J Pharm Res,2023,10(11):147-58.3 CIOC RC,JOYCE C,MAYR M,et al.Formation ofN-nitrosamine drug substance related impurities inmedicines:a regulatory perspective on risk factors andmitigation strategiesJ.Org Process Res Dev,2023,27(10):1736-50.4 SCHLINGEMANN J,BOUCLEY C,HICKERT S,et al.Avoiding N-nitroso dimethylamine formation in met-formin pharmaceuticals by limiting dimethylamine andnitriteJ.Int J Pharm,2022,620:121740.5 BOETZEL R,SCHLINGEMANN J,HICKERT S,et al.A nitrite excipient database:a useful tool to supportN-nitrosamine risk assessments for drug products.JDetermination of Trace Nitrate and Nitrite in Pharmaceutical Lactose byIon Chromatography-Conductivity/Ultraviolet Detections*ZHU Lin*,CHEN Xinru,SHI Haiwei2,ZHOU Xiaohua2,YUAN Yaozuo2,ZHU Xiaoyue12jiangsu Institute for Food and Drug Control,Nanjing 210019,China;2NMPA Key Laboratory for ImpurityProfile of Chemical Drugs,Nanjing 210019,China;3China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,Chi-naABSTRACT Objective:To establish ion chromatography-suppressed conductivity detection(IC-CD)andhigh performance liquid chromatography-ultraviolet detection(HPLC-UV)methods to determine the contentsof trace nitrite and nitrate in pharmaceutical lactose.LC-MS/MS technology was combined with the con-struction of an online membrane suppression system to confirm the structures.It is to provide new strate-gies for pre-risk control of pharmaceutical lactose.Methods:The high-capacity anion-exchange column ofDionex IonPacTM AS11-HCR FICTM(4.0mm250mm)and the guard column of Dionex IonPacM AS11-HCRFICTM(4.0mm 50 mm)were used for both IC-CD and HPLC-UV methods.In the IC-CD method,potassi-um hydroxide solution was applied for gradient elution and the suppressed conductivity cell temperature was30C.In the HPLC-UV detection method,the mobile phase was 5 mmolL-I sodium hydroxide solution andthe detection wavelength was 210 nm.The flow rates and column temperatures of the two methods were setat 1.0 mLmin-l and 30C,respectively.The injection volumes were 25 L.Results:The two determinationmethods had good linear relationship(r0.999)for nitrite in the range of 0.03-10 gmL-,and for nitratein the range of 0.02-200 gmL-,while the LOD and LOQ were 0.25 ng and 0.75 ng for nitrite,0.25 ngand 0.50 ng for nitrate,respectively.The recoveries were between 84.00%-100.70%.The RSD(n=6)ofinjection precision were between 0.27%-1.33%.The above results all met the inspection requirements.Conclusion:The two methods have high sensitivity,excellent specificity,good separation and simple pre-processing,which can characterize the contents of trace nitrite and nitrate in pharmaceutical lactose,andalso provides new ideas and references for pre-risk study of other pharmaceutical excipients.KEY WORDS Lactose;Pharmaceutical excipients;Nitrite;Nitrate;Ion chromatography-suppressed conduc-tivity detection;High performance liquid chromatography-ultraviolet detectionPharm Sci,2023,112(6):1615-24.6印卫东.药用辅料对药品安全性的影响分析 中文科技期刊数据库(引文版)医药卫生，2 0 2 3(5)：30-3.7吴兴兴，唐力，朱怡君，等。分光光度法测定药用辅料中亚硝酸盐的含量 J.生物化工，2 0 2 1,7(2)：8 3-5.8张大伟，可用于痕量亚硝酸盐污染物智能检测的碳点发光材料的研究 D.吉林大学，2 0 2 3.9邹沫君.离子色谱法测定牛奶及奶制品中硝酸盐和亚硝酸盐 J。食品工业，2 0 2 3，44(7)：30 4-8.10 郝瑞婷，陈永艳，王瑜，等离子色谱法测定尿液中的硝酸盐 中国卫生检验杂志，2 0 2 2,32(9)：10 50-2.11 盖成，郝丽娟，闫凯，等高效液相色谱法测定羟丙甲纤维素中亚硝酸盐含量 中国药业，2 0 2 3，32(6):85-8.121