miRNA-30b-3p靶向ZNRF1调控草酸钠诱导的HK-2细胞凋亡和氧化应激的研究.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(1):009-016 J Med Mol Biol,2024,21(1):009-016DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.01.002资助项目:山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(No.BS2018SW115)通讯作者:于大鹏(电话:[phone],E-mail:)This work was supported by a grant from the Shandong Province Outstanding Young and Middle-Aged Scientists Research Award Fund(No.BS2018SW115)Corresponding author:YU Dapeng(Tel:[phone],E-mail:)miRNA-30b-3p 靶向 ZNRF1 调控草酸钠诱导的 HK-2 细胞凋亡和氧化应激的研究于大鹏1,丁友鹏1,李勉洲1,张荣远1,21济宁市第一人民医院泌尿外科 山东省济宁市,2721002香港中文大学深圳研究院 广东省深圳市,518172【摘要】目的 探索 miRNA-30b-3p 靶向 ZNRF1 调控草酸钠诱导的 HK-2 细胞凋亡和氧化应激的研究并探讨其作用机制。方法 将 0.2、0.6 mol/L 的草酸钠处理 HK-2 细胞,miR-30b-3p mimic 和 miR-30b-3p in-hibitor 及其相对应的对照物转染到 HK-2 细胞,CCK-8、Transwell 和划痕实验分别检测 HK-2 细胞的增殖、侵袭和迁移能力;流式细胞术测量细胞内 ROS,ELISA 法检测 LDH、MDA、GSH 活性,蛋白质印迹分析Bax、Bcl-2 的表达情况;荧光素酶报告基因检测验证 miRNA-30b-3p 及 ZNRF1 之间的靶向关系;RNA 免疫沉淀分析 miRNA-30b-3p 及 ZNRF1 之间的作用关系。结果 草酸钠处理 HK-2 显著增加 ROS,LDH 和 MDA水平,GSH 含量明显降低(P0.01),抑制 HK-2 细胞的增殖、迁移和侵袭,促进其凋亡,与草酸钠的浓度呈现剂量依赖关系,miR-30b-3p 促进草酸钠诱导对 HK-2 细胞的影响;靶标预测和荧光素酶测定表明 ZN-RF1 是 HK-2 细胞中 miR-30b-3p 的直接靶标,且沉默 ZNRF1 逆转 miR-30b-3p 对草酸钠诱导的 HK-2 细胞损伤的影响。结论 miRNA-30b-3p 靶向 ZNRF1 促进草酸钠诱导的 HK-2 细胞凋亡和氧化应激,抑制其增殖、侵袭和迁移。【关键词】miRNA-30b-3p;ZNRF1;草酸钠;HK-2;氧化应激【中图分类号】R33miR-30b-3p Regulates Sodium Oxalate Induced Apoptosis and Oxida-tive Stress in HK-2 Cells by Targeting ZNRF1YU Dapeng1,DING Youpeng1,LI Mianzhou1,ZHANG Rongyuan1,21Department of Urology,Jining First Peoples Hospital,Jining,Shandong,272100,China2Shenzhen Research Institute,the Chinese University of Hong Kong,Shenzhen,Guangdong,518172,China【Abstract】Objective To explore the effect of miR-30b-3p on HK-2 cell proliferation,apopto-sis and oxidative stress induced by sodium oxalate and the mechanism by targeting ZNRF1.Methods HK-2 cells were treated with 0.2 mol/L or 0.6 mol/L sodium oxalate.miR-30b-3p mimic andmiR-30b-3p inhibitor and their corresponding control were transfected into HK-2 cells.The prolifera-tion,invasion and migration of HK-2 cells were detected by CCK-8,transwell and wound-healingassay,respectively.Intracellular ROS was measured by flow cytometry.The activities of LDH,MDAand GSH were detected by ELISA.The expression levels of Bax and Bcl-2 were analyzed by Westernblotting.Luciferase gene reporter assay was used to verify the targeting relationship between miR-30b-3p and ZNRF1.The relationship between miR-30b-3p and ZNRF1 was analyzed by RNA immu-noprecipitation.ResultsSodium oxalate treatment significantly increased ROS,LDH and MDAlevels and decreased GSH levels in HK-2 cells(P0.01).Sodium oxalate also inhibited the prolif-eration,migration and invasion,and promoted apoptosis of HK-2 cells.miR-30b-3p promoted theeffect of sodium oxalate on HK-2 cells.The results of gene target prediction and luciferase assay indi-cated that ZNRF1 is a direct target of miR-30b-3p in HK-2 cells,and ZNRF1 silencing reversedthe effect of miR-30b-3p on sodium oxalate induced HK-2 cell damage.ConclusionmiR-30b-3pcan promote the apoptosis and oxidative stress induced by sodium oxalate in HK-2 cells,and inhibitcell proliferation,invasion and migrationvia ZNRF1.【Key words】miR-30b-3p;ZNRF1;sodium oxalate;HK-2;oxidative stress慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是一个主要的公共卫生问题,在一般人群中的总患病率约为 14%。CKD 的特征是由肾单位功能进行性丧失引起的肾脏滤过功能受损,肾单位被间质纤维化所取代。肾损伤的发生和进展与多种分子事件有关,如离子蓄积、线粒体功能障碍、氧化应激活化、炎症和细胞凋亡1。虽然许多细胞活动与肾脏损伤有关,但活性氧(reactive oxygen species,ROS)被证明是关键的介质,因为 ROS 清除的增强可以缓解肾脏损伤2-3。以前的研究表明,减轻氧化应激能够减轻肾脏损伤4。因此,找到减少肾损伤产生的氧化应激的策略越来越有意义。microRNA(miRNA)是一类短的内源性非编码单链 RNA,含有 21 25 个核苷酸。它们通过靶向特定的 mRNA 来破坏 mRNA 的稳定性,抑制蛋白质产生和沉默翻译,在基因表达转录后发挥关键的调节作用5。凭借这种强大的调节功能,miRNA与各种生物过程相关,包括增殖、分化和细胞凋亡6-7。大量证据表明,miRNA 参与许多疾病的发病机制,可以修饰基因表达8,并且已经发现miRNA 失调与主要肾脏疾病相关9。尽管先前的研究已表明 miRNA 在调节肾脏生理功能和肾稳态中的重要性,但这种 miRNA 的确切身份在很大程度上仍然未知。因此,了解 miRNA 在肾损伤发病机制中的潜在分子机制可能有助于开发治疗和预防肾损伤的先进药物治疗方法。高草酸尿症是草酸盐晶体发生的主要危险因素之一。高草酸尿症可能受特定饮食10(如素食主义)或肠道微生物组成的影响11。目前,人们普遍认为这些晶体会诱发肾结石和全身性疾病,包括慢性肾脏疾病和肾功能衰竭、代谢紊乱和心血管疾病12。在这项研究中,我们利用草酸钠诱导的 HK-2细胞模型,研究 miRNA-30b-3p 靶向 ZNRF1 调控HK-2 细胞凋亡和氧化应激的影响。1 材料和方法1.1 细胞培养正常原代肾小管 HK-2 细胞系购自中国型培养中心。HK-2 细胞在 RPMI 1640 培养基中与10%胎牛血清在 37,5%CO2的细胞加湿培养箱中进行培养,当细胞汇合度达到 80%时,将草酸钠(0.2、0.6 mol/L)分别加入 HK-2 细胞中进行研究。1.2 细胞转染消化并收集对数生长阶段的 HK-2 细胞,按照密度为 1 106个/孔接种到六孔板中。培养 24 h后,根据试剂盒操作方案,使用 LipofectamineTM2000 转染试剂将 miR-30b-3p mimic 和 miR-30b-3pinhibitor 及其相对应的对照组转染到 HK-2 细胞中。1.3 CCK-8将相对应组别的细胞并以 1 104个/孔的密度接种到 96 孔板中。每组细胞设置有 3 个重复孔。在细胞孵育 0、24、48 和 72 h 后,向每个孔中加入 20 L 的 CCK-8 试剂。通过自动酶标记物检测A450 nm,该标记物评估活细胞的数量。1.4 靶标预测和荧光素酶测定TargetScan 在 线 工 具(http:/www.tar-getscan.org/vert_ 72)预测 miR-30b-3p 潜在的靶基因。为了确认 miR-30b-3p 和 ZNRF1 在 HK-2 细胞中的相互作用,将 HK-2 细胞按照 4 104个/孔接种到六孔板中,并在 37 下培养 24 h。随后,将 HK-2 细胞的野生型(WT)和突变型(MUT)3-UTR 克隆到荧光素酶报告载体 PsiCheck2 中。MUT 序列使用定点诱变试剂盒生成。根据制造商的方案,将 WT 和 MUT HK-2 细胞荧光素酶质粒(100 ng)与 miR-30b-3p 和相应的 NC 共转染到HK-2 细胞中。在 37 孵育 48 h 后,使用双荧光素酶报告检测系统测量相对荧光素酶活性,萤火虫荧光素酶活性被标准化为雷尼拉萤光素酶活性。1.5 蛋白质印迹分析将样品在含有 3.1 mmol/L 蔗糖、1 mmol/L 二硫苏糖醇、10 g/mL 亮肽素、10 g/mL 大豆胰蛋白酶抑制剂、2 g/mL 抑肽酶和 0.1%Triton X-100 的 50 mmol/L 裂解缓冲液(pH 7.4)中在冰上超声处理 5 s。将匀浆在 4 下以 5 000 r/min 离心20 min,收集上清液。使用 BCA 试剂盒测量总蛋白质浓度。使用 12%SDS-PAGE 分离蛋白质裂解物(20 g)并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用 5%脱脂牛奶封闭后,将聚偏二氟乙烯膜与一抗孵育。01于大鹏,等.miRNA-30b-3p 靶向 ZNRF1 调控草酸钠诱导的 HK-2 细胞凋亡和氧化应激的研究在 TBS-T 中洗涤膜(10 min 3),然后用适当的二抗(110 000)。膜使用 VersaDoc 5000 开发,条带密度用 Quantity One 4.6 软件测量,通过兔多克隆抗体测量 GAPDH 水平。1.6 酶联免疫吸附测定(ELISA)乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二 醛(malondialdehyde,MDA)和 谷 胱 甘 肽(glutathione,GSH)根据试剂盒说明书测量细胞培养上清液中 LDH、MDA 和 GSH 的水平。1.7 流式细胞术测量细胞内 ROS将 HK-2 细胞培养在六孔板中,并用草酸钠处理。收获 HK-2 细胞并用 DCFH-DA(2,7-二氯荧光素二乙酸酯)处理 0.5 h,然后用 PBS 洗涤,并通过流式细胞术分别在 485 nm 和538 nm 处激发和发射测量细胞内 ROS 的产生。1.8 Transwell在 Transwell 板的上室涂覆 1 mg/mL 的基质胶,并在下室中加入 DMEM(dulbeccos modified eaglemedium)培养基。将 2 105个 HK-2 细胞接种在上室并在室内温度下培养。将渗入下腔室的细胞固定并用结晶紫染色。将随机选择的字段置于显微镜下进行计数。1.9 划痕实验用 100 L 移液器吸头刮除接种在六孔板上的每组细胞,以产生两个没有细胞的线性区域,用考马斯亮蓝染色细胞,并使用 ImagePro 6.0 在不同时间点对两个线性区域之间的划痕距离进行成像和测量,选择每个孔中的 5 个随机非重叠图像并进行定量以进行统计分析。1.10 统计学分析所有数据均表示为平均值 标准差。使用单因素方差分析对多组进行比较,当方差均匀时,使用最不显著差异 T(LSD-t)检验。所有获得的数据均使用 GraphPad v7.0 软件进行统计分析。2 结果2.1 草酸钠诱导的 HK-2 细胞氧化应激损伤为研究草酸钠对 HK-2 细胞氧化损伤的影响,本研究采用不同浓度的草酸钠(0.2 mol/L,0.6mol/L)处理 HK-2 细胞 48 h,我们发现草酸钠处理 HK-2 显著增加了 ROS 生成(P 0.01),LDH释放(P 0.01),细 胞 MDA 明 显 增 加(P 0.01),GSH 含量明显降低(P0.01),且都与草酸钠的浓度呈现剂量依赖关系(图 1)。A:ROS 的相对表达水平;B:LDH 相对释放水平;C:MDA 生成量;D:GSH 含量。1:对照组;2:0.2 mol/L草酸钠组;3:0.6 mol/L 草酸钠组。与对照组比较,P0.05,P0.01。图 1 草酸钠诱导 HK-2 细胞氧化应激损伤2.2 草酸钠诱导对 HK-2 细胞增殖凋亡,迁移及侵袭的影响 为研究草酸钠对 HK-2 细胞增殖凋亡,迁移及侵袭的影响,本研究采用 CCK-8 法检测 HK-2 细胞的增殖情况(图 2A),Transwell 检查 HK-2 细胞的侵袭个数(图 2B),划痕试验检查其迁移率(图2C),蛋白质印迹检测 Bax 和 Bcl-2 的蛋白表达水平反映 HK-2 细胞的凋亡情况(图 2D),由图 2 结11医学分子生物学杂志,2024,21(1):009-016 J Med Mol Biol,2024,21(1):009-016果可知,与 Control 组相比,草酸钠组 HK-2 细胞的增殖、侵袭、迁移能力明显受到抑制(P 0.01),但是促进其凋亡能力(P 0.01),且随着草酸钠的浓度的增加作用更加明显。A:CCK-8 法检测 HK-2 细胞的增殖;B:Transwell 检查 HK-2 细胞的侵袭个数(100);C:划痕试验检查 HK-2 细胞迁移率(200);D:蛋白质印迹检测 Bax 和 Bcl-2 的蛋白表达水平。1:对照组;2:0.2 mol/L 草酸钠组;3:0.6 mol/L 草酸钠组。与 Control 比较,P0.05,P0.01。图 2 草酸钠诱导对 HK-2 细胞增殖凋亡,迁移及侵袭的影响2.3 miR-30b-3p 促进 HK-2 细胞中草酸钠诱导的氧化应激损伤 为了确定草酸钠是否影响 HK-2 细胞中 miRNA的表达水平,我们测定了用 0.2、0.6 mol/L 的草酸钠处理的 HK-2 细胞中的 miRNA 水平。结果发现,与 Control 组相比,草酸钠组的 miR-30b-3p 显著上调;因此,我们选择 miR-30b-3p 作为感兴趣的 miRNA 进行研究,结果表明 miR-30b-3p inhibi-tor 组的 miR-30b-3p 显著降低(P0.01),表明细胞转染成功(图 3)。图 4 结果表明,miR-30b-3pinhibitor 治疗显著降低了 ROS 生成,减少了 LDH释放,降低了 MDA 水平,同时增加了 HK-2 细胞中 GSH 的含量,但这种影响因为有草酸钠的存在而降低 miR-30b-3p inhibitor 治疗效果。1:对照组;2:0.2 mol/L 草酸钠组;3:0.6 mol/L草酸钠组;4:miR-30b-3p inhibitor 组。与 Control 比较,P0.01。图 3 miR-30b-3p 的相对表达水平21于大鹏,等.miRNA-30b-3p 靶向 ZNRF1 调控草酸钠诱导的 HK-2 细胞凋亡和氧化应激的研究A:ROS 的相对表达水平;B:LDH 相对释放水平;C:MDA 生成量;D:GSH 含量。1:对照组;2:miR-30b-3pinhibitor+NC 组;3:0.6 mol/L 草酸钠组;4:miR-30b-3p inhibitor 组;5:0.6 mol/L 草酸钠+miR-30b-3p in-hibitor 组。与 Control 比较,P0.01;与 Control 比较,#P 0.05),ZNRF1 可能是miR-30b-3p 的直接靶标,图 5D 结果表明 miR-30b-3p 靶向 ZNRF1 呈负相关调节。A:ZNRF1 与 miR-30b-3p 的结合位点;B:双荧光素酶报告基因检测;C:miR-30b-3p 的相对表达水平;D:ZNRF1mRNA 的相对表达水平。1:对照组;2:miR-30b-3p mimics 组;3:miR-30b-3p inhibitor 组。与 NC 组比较,P0.05,P0.01。图 5 ZNRF1 是 HK-2 细胞中 miR-30b-3p 的直接靶标2.5 沉默 ZNRF1 逆转 miR-30b-3p 抑制剂对的 HK-2 细胞氧化应激的保护作用 草酸钠处理的 HK-2 细胞的 RT-qPCR 分析显示ZNRF1 表达以剂量依赖性方式下调,显示转染 si-ZNRF1 成功(图6)。我们在细胞中si-ZNRF1 进行了miR-30b-3p 抑制剂的组合实验,结果表明0.6 mol/L+inhibitor+si-ZNRF1 组与0.6 mol/L+inhibitor+si-NC 组相比,ROS 含量,LDH、MDA 含量明显升高(P 0.01),GSH 水平显著降低(P 0.01)(图 7)。这种结果表明沉默 ZNRF1 逆转 miR-30b-3p 抑制剂对的 HK-2 细胞氧化应激的保护作用。1:对照组;2:0.2 mol/L 草酸钠组;3:0.6 mol/L草酸钠组;5:si-NC 组;6:si-ZNRF1 组。与 Control 比较,P0.01。图 6 ZNRF1 的相对表达水平31医学分子生物学杂志,2024,21(1):009-016 J Med Mol Biol,2024,21(1):009-016A:ROS 的相对表达水平;B:LDH 相对释放水平;C:MDA 生成量;D:GSH 含量。1:0.6 mol/L 草酸钠+miR-30b-3p inhibitor;2:0.6 mol/L 草酸钠+miR-30b-3p inhibitor+si-NC 组;3:0.6 mol/L 草酸钠+miR-30b-3p inhibi-tor+si-ZNRF1。与 0.6 mol/L 草酸钠+miR-30b-3p inhibitor+si-NC 组比较,P0.01。图 7 沉默 ZNRF1 逆转 miR-30b-3p 抑制剂对的 HK-2 细胞氧化应激的保护作用2.6 沉默 ZNRF1 逆转 miR-30b-3p 抑制剂对的 HK-2 细胞损伤的保护作用为了进一步验证 ZNRF1 参与 miR-30b-3p 对HK-2 的保护作用,我们在细胞中沉默 ZNRF1,然后与 miR-30b-3p 抑制剂组合实验。结果发现,与0.6 mol/L+miR-30b-3p inhibitor+si-NC 组相比,0.6 mol/L+miR-30b-3p inhibitor+si-ZNRF1 组中 HK-2 细胞的增殖能力降低(P0.01),侵袭和迁移能力降低(P 0.01),凋亡能力上升(P 0.01)(图 8)。以上结果表明沉默 ZNRF1 逆转 miR-30b-3p 抑制剂对草酸钠诱导的 HK-2 的保护作用。A:CCK-8 法检测 HK-2 细胞的增殖;B:Transwell 检查 HK-2 细胞的侵袭个数(100);C:划痕试验检查 HK-2细胞迁移率(200);D:蛋白质印迹检测 Bax 和 Bcl-2 的蛋白表达水平。1:0.6 mol/L 草酸钠+miR-30b-3pinhibitor 组;2:0.6 mol/L 草酸钠+miR-30b-3p inhibitor+si-NC 组;3:0.6 mol/L 草酸钠+miR-30b-3p inhibi-tor+si-ZNF1 组。与 0.6 mol/L+miR-30b-3p inhibitor 组比较,P0.05,P0.01。图 8 沉默 ZNRF1 逆转 miR-30b-3p 抑制剂对 HK-2 细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响41于大鹏,等.miRNA-30b-3p 靶向 ZNRF1 调控草酸钠诱导的 HK-2 细胞凋亡和氧化应激的研究3 讨论慢性肾脏病是我国常见慢性病之一,目前慢性肾脏病是全球死亡率中排第 11 位的疾病13,部分原因是心血管并发症14,考虑到疾病的负担和临床意义,对肾脏疾病的治疗和研究已然成为现代医药和制药工业的主要目标。在本研究中,我们通过研究 miR-30b-3p 促进HK-2 细胞中草酸钠诱导的氧化应激损伤,表明miR-30b-3p 可能是草酸钠诱导的 HK-2 细胞的临床标志物。在哺乳动物中,尽管饮食摄入量很大,但血清中草酸盐的浓度仍然很低;然而,在肾小球滤过液中,草酸盐浓度可能变得相当高。随着水的重吸收,管状系统中的草酸盐浓度上升到饱和点以上(过饱和度),草酸盐形成草酸钙晶体15。虽然肾结石的主要成分是草酸钙,但是机体摄入的草酸盐量过高更容易形成结石。肾脏中 ROS 增加会导致肾小管细胞发炎和损伤,从而促进草酸盐晶体的形成。氧化应激是 ROS 的产生超出了抗氧化酶(如超氧化物歧化酶)的保护能力。近年来,氧化应激在肾结石形成中的作用越来越受到关注16-17。越来越多的证据表明,氧化应激诱导的肾损伤可能是在较高的草酸盐浓度下促进草酸盐晶体在肾脏中沉积的关键因素,我们的研究发现,草酸钠在高浓度下,ROS、LDH 和 MDA 的水平明显增高,GSH的含量显著降低,与之前他人的论证结果一致,草酸盐晶体在肾脏中沉积还可能通过线粒体破坏诱导细胞凋亡。此外,许多研究还表明,通过体内抗氧化治疗可以显著降低肾草酸盐晶体沉积18-19。众所周知,miRNA 在细胞生物学的各种过程中起着关键作用。许多研究人员发现 miRNA 在肾结石的发病机制中起着重要作用20。我们的结果表明,HK-2 细胞中的草酸盐显著增加了 miR-30b-3p 的水平。我们还发现 miR-30b-3p 过表达显著增加了 ROS 生成、LDH 释放和细胞 MDA 水平,降低了 GSH 的含量,而 miR-30b-3p 抑制剂具有相反的效果。以上所有结果表明,miR-30b-3p 敲低显著逆转了草酸钠通过直接靶向 ZNRF1 的 3-UTR 区域诱导 HK-2 细胞中的氧化应激反应。ROS 是神经元死亡的主要诱因,ROS 通过神经元凋亡和轴突变性激活 ZNRF1,ZNRF1 是一种靶向神经元中 AKT 的泛素连接酶21。ZNRF1 通过UPS 降解 AKT 来促进氧化应激诱导的神经元凋亡,氧化应激诱导 ZNRF1 在第 103 个酪氨酸残基(Y103)处磷酸化,从而增加其泛素连接酶的活性,以靶向神经元中的 AKT 蛋白。抗磷酸化突变体 ZNRF1 Y103F 的过表达保护神经元免受 6-羟基多巴胺(6OHDA)诱导的细胞凋亡,其程度类似于显性阴性突变体 ZNRF1 C184A22。总之,我们的研究结果表明 miR-30b-3p 敲低抑制体外的 ZNRF1 表达,从而保护肾脏免受草酸钠诱导的细胞凋亡和氧化应激损伤,抑制 HK-2 细胞增殖、侵袭和迁移。综上所述,miR-30b-3p 可作为草酸钠患者的潜在靶标。参考文献1 WANG L,CHEN H,LIU X H,et al.Ozone oxidative pre-conditioning inhibits renal fibrosis induced by ischemiaand reperfusion injury in ratsJ.Exp Ther Med,2014,8(6):1764-1768.2 DEVARAJAN P.Update on mechanisms of ischemic acutekidney injuryJ.J Am Soc 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