快速滤过型净化结合超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中5种农药残留量.pdf
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1、云南师范大学学报(自然科学版),2 0 2 4,4 4(2):5 4-6 0 h t t p s:/q k g j.y n n u.e d u.c nJ o u r n a l o fY u n n a nN o r m a lU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e sE d i t i o n)D O I:1 0.7 6 9 9/j.y n n u.n s-2 0 2 4-0 2 5快速滤过型净化结合超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中5种农药残留量*杜鑫,易珊珊*,何家国,覃明丽,苏旭,陈绍辉,蒋金芳(南充农产品质量监测检验中心,四川
2、南充6 3 7 0 0 0)摘要:采用滤过型净化柱净化(m-P F C),结合超高效色谱-串联质谱仪(U P L C-M S/M S)建立了同时检测茶叶中噻螨酮、唑螨酯、炔螨特、噻嗪酮和阿维菌素等5种农药残留的方法.样品加水浸润后经乙酸乙腈均质提取,Q u E C h E R S盐包分层,取上层提取液经m-P F C柱净化,液相色谱-质谱联用仪测定.质谱采用电喷雾正离子模式(E S I+)和多反应监测模式(MRM)进行分析,基质外标法定量.结果表明:5种农药在1.0 01 0 0.0 0gL-1范 围 内 线 性 关 系 良 好,线 性 相 关 系 数(r)均 大 于0.9 9 9,定 量 限
3、 均 为5.0gk g-1,检出限为1.22.2gk g-1.在5.0 02 5 0.0 0gk g-1添 加 水 平 范 围 内,回 收 率为7 1.5%1 0 9.9%,相对标准偏差(R S D)为2.6%8.4%.关键词:快速滤过型净化;农药残留;超高效液相色谱-串联质谱;茶叶中图分类号:0 6 5 7.6 3;T S 2 7 2.7 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 7-9 7 9 3(2 0 2 4)0 2-0 0 5 4-0 7 茶叶中富含茶多酚、黄酮和茶多糖等多种活性物质,具有抗氧化、助消化、抗疲劳、抗癌和抗炎的作用,有助于降低患高胆固醇和心血管疾病的风险,对人体健康有很大益
4、处1-2.茶树适宜生长在地势高、湿度大的地区,在生长过程中容易出现病虫害,为提高茶叶的产量和质量,在茶叶生长过程中多采用喷施农药来进行病虫害的防治.噻螨酮、唑螨酯、炔螨特、噻嗪酮和阿维菌素等杀虫杀螨剂具有选择性强、速效性好及持效期长等特点3,可用于防治茶叶生长过程中的茶短须螨、咖啡小爪螨、茶跗线螨、茶毛虫、茶尺蠖、茶刺蛾及黑刺粉虱等病虫害4-5,但茶叶中农药残留问题一直受到广泛关注4.茶叶中含有大量的色素、嘌呤生物碱和茶多酚等物质,基质复杂,而茶叶农药残留的含量较低,检测困难.良好的净化前处理方法不仅消除大部分基质干扰,还可以延长分析仪器使用寿命.Q u E C h E R S方法具有操作简易
5、、溶剂用量少和分析速度快等优点,被广泛应用于各类样品的前处理 过 程5-9.快 速 滤 过 型 净 化 法(M u l t i-p l u gf i l t r a t i o nc l e a n u p,m-P F C)是一种结合固相萃取净化原理和Q u E C h E R S方法开发的新型快速样品前处理净化技术1 0-1 6.该技术通过筛板将复合型多壁碳纳米管(M u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s,MWC NT s)、乙 二 胺-N-丙 基 硅 烷(P r i m a r y-s e c-o n d a r ya m i n
6、e,P S A)、石 墨 化 炭 黑(G r a p h i t i z e dc a r b o nb l a c k,G C B)和十八烷 基硅烷键合 硅胶(C1 8)等吸附剂材料固定于注射器中,通过单次或反复推拉注射器活塞,使提取液中的色素、有机酸、脂肪和糖类等杂质与填料层作用,但目标物不被吸附,从而实现萃取净化一步完成,大大缩短净化时间,净化速度快,前处理效率高,已用于海产品1 0、鸡 蛋1 1、大 豆1 2、果 蔬1 3、人 参1 4和 茶叶1 5-1 7等 的 农 药 残 留 检 测 前 处 理.本 研 究 将m-P F C净化方法与U P L C-M S/M S技术相结合,建立了
7、同时快速检测茶叶中5种农药残留量的检测方法,优化了测定条件,实现了简便、快速且准确地检测大批量茶叶样品.*收稿日期:2 0 2 4-0 1-0 3作者简介:杜鑫(1 9 8 8-),男,四川达州人,高级农艺师,四川省检验检测机构资质认定评审员(2 0 2 1 2 3 0 1 2 5),主要从事农畜水产品检测方面研究.通信作者:易珊珊.E-m a i l:2 8 2 6 5 2 2 0 3q q.c o m.1 材料与方法1.1 试剂与仪器噻螨酮、唑螨酯、炔螨特、噻嗪酮和阿维菌素等标准品均购于农业农村部环境质量监督检验测试中心(天津),浓度均为1 0 0 0m gL-1,保存于-1 8冰箱.甲醇
8、、乙腈、浓氨水、甲酸和乙酸铵均为质谱级,乙酸为优级纯.Q u E C h E R S盐包(含4gM g S O4,1gN a C l,1.5g柠檬酸钠)、陶瓷均质子(2c m1c m)和Q u E C h E R S试剂盒均购于美国A g i l e n t公司.KNO R TH m-P F CC-5(深色基质)净化柱(5m L/8 0 0m g,3 0 0m g M g S O4,1 3 0m gC 1 8,2 5 0m gP S A,1 2 0m gMWC NT s)购于北京科德诺思技术有限公司.W a t e r s A C QU I T Y U P L C H-C l a s s/X
9、e v oT Q-S超高效液相色谱-串联质谱仪(美国W a t e r s公司),ML 8 0 2型 电 子 分 析 天 平(瑞 士M e t t l e rT o l e d o公司),G D 1 6 p l u s高速研磨均质仪(深圳市新锐科技有限公司),3-1 8 K S型高速冷冻离心机(德国S i g m a公司),V o r t e xG e n i u s3型旋涡混合器(德国I KA公司),M i l l i-Q型超纯水仪(美国M i l l i p o r e公司),5 0m L离心管(上海康宁有限公司),P T F E(0.2 2m)针筒式微孔滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)
10、.1.2 样品制备茶叶样品(绿茶、红茶、白茶和黑茶等)均购买于某地市场销售门市和茶叶加工厂.取代表性的茶叶样品5 0 0g放入粉碎机中粉碎,样品全部过4 2 5m的标准网筛,混匀后装入洁净的聚乙烯塑料样品袋中,密封并注明标记,将试样于-1 8冷冻保存.1.3 样品提取准确称取2.0 0g粉碎后的茶叶样品于5 0m L离心管中,加入1 0m L水涡旋混匀后静置浸泡1 0m i n,依次加入1颗陶瓷均质子、1袋Q u E C h E R S盐包和1 0.0 0m L乙酸+乙腈溶液(体积比19 9),拧紧离心管盖,放入低温(5)高速研磨均质仪中3 0 0 0rm i n-1均质提取4m i n,然后
11、5 0 0 0rm i n-1离心3m i n,收集上清液待净化.1.4 样品净化m-P F C净化法:茶叶样品前处理流程如图1所示.在m-P F C净化柱前端预先串联装上2个0.2 2m有机微孔滤膜,下接进样瓶,取2m L上清液于净化柱中,手动缓慢推动注射杆,使上清液缓慢通过净化柱填料层和微孔滤膜,控制液滴速度1滴/s,直接转移到进样瓶,盖上瓶盖,摇匀后即得上机待测液.Q u E C h E R S方法:吸取5m L上清液加到内含12 0 0 m g M g S O4+4 0 0 m gP S A+4 0 0 m gG C B的1 5m L净化管中,涡旋混匀2m i n,5 0 0 0rm
12、i n-1离心3m i n,吸取2m L上清液过0.2 2m滤膜,即得待测液.图1 茶叶样品前处理流程图F i g.1 F l o wc h a r to f t e as a m p l ep r e t r e a t m e n t55 第2期 杜鑫,等:快速滤过型净化结合超高效液相色谱-串联质谱法测定茶叶中5种农药残留量1.5 仪器分析条件1.5.1 色谱条件用W a t e r sX B r i d g eC1 8色谱柱(1 0 0 mm3.0mm,3.5m),柱温为4 0.0,样品室温度为1 8,自动进样体积为1.0 0L;流动相为含有体积分数为0.0 5%甲酸的甲醇(A)、体积分
13、数为0.1%氨水的水溶液(B)及乙腈(C)组成的混合溶液,按表1中的梯度洗脱程序分离目标物.表1 U P L C流动相组成和梯度洗脱程序T a b l e1 T h eg r a d i e n t e l u t i o np r o g r a mo fU P L Cm o b i l ep h a s e时间/m i n流速/(m Lm i n-1)A/%B/%C/%梯度曲线开始0.4 01 58 5061.50.4 01 58 5064.50.4 01 51 57 066.00.4 0059 569.50.4 0059 561 0.00.4 01 58 5061 2.00.4 01 5
14、8 5061.5.2 质谱条件采用电喷雾离子源,其温度设为1 5 0,毛细管电压为3.0k V,锥孔气和脱溶剂气都用高纯氮气,锥孔气流量为1 5 0Lh-1,脱溶剂气温度为5 0 0,其流量为1 0 0 0Lh-1,碰撞气为高纯氩气,其流量为0.1 2m Lm i n-1.在电喷雾正离子(E S I+)模式下,选择多反应监测(MRM)方式采集数据,质谱仪信号采集时间段为3.57.8m i n,利用质谱仪的在线切换阀将其他时间段的色谱流动相切换到废液,从而减小仪器污染,延长仪器使用寿命.1.6 标准溶液的配制将5种农药的标准品分别用色谱级乙腈逐级稀释成1 0.0m gL-1标准溶液储备液;准确吸
15、取1.0 0m L上述单一标准溶液于同一个1 0m L容量瓶中,乙腈定容后摇匀,得到1.0 0gm L-1混合标准溶液,于-1 8避光保存.取筛选出的空白茶叶样品按前处理方法制成空白基质溶液,精确吸取一定量的混合标准溶液,用空白基质稀释成质量浓度为1.0 0、5.0 0、1 0.0 0、2 5.0 0、5 0.0 0gL-1和1 0 0.0 0gL-1基质匹配标准工作溶液,现用现配.2 结果与分析2.1 液相色谱-质谱条件优化在E S I+模式下,选取甲醇(A相)、水(B相)和乙腈(C相)为流动相.样品提取液为酸化乙腈,选择在水相中加入少量氨水来改善目标物的峰形拖尾,提高5种农药的电喷雾离子化
16、效率.在甲醇中加入少量甲酸后,有利于流动相形成一个稳定的缓冲体系,改善目标物峰形.为方便用质谱直接进样的方式来优化质谱条件,用乙腈+水(7 0+3 0,V/V)配制0.5 0m gL-15种农药的标准溶液.在不同流动相体系对5种农药的母离子及子离子进行全扫描,分析其响应信号强度,结合仪器“I n t e l l i s t a r t”功能快速优化出的质谱检测参数见表2.表2 5种农药的质谱检测参数T a b l e2 M a s ss p e c t r o m e t r yp a r a m e t e r s f o r t h ed e t e r m i n a t i o no
17、f 5p e s t i c i d er e s i d u e s农药保留时间/m i n母离子/(m/z)定量子离子/(m/z)定性子离子/(m/z)锥孔电压/V碰撞能量/V噻螨酮7.1 73 5 3.22 2 8.11 6 8.13 22 6/2 2唑螨酯7.2 14 2 2.33 6 6.22 3 1.22 42 6/2 8炔螨特7.2 33 6 8.22 3 1.21 7 5.21 81 4/2 0噻嗪酮7.2 73 0 6.21 0 6.17 5 1.72 62 4/2 0阿维菌素7.6 18 9 5.81 1 6.13 2 7.42 55 0/4 465云南师范大学学报(自然科
18、学版)第4 4卷 采用色谱进样,观察目标物的保留时间、峰形和响应信号强度,优化后的流动相梯度体系见表1.在8m i n内5种农药(图2)全部出峰,峰形及分离度很好,都有较强的分子离子峰强度.采用甲醇-乙腈-水体系并加入少量氨水和甲酸后,有效提高了目标物的离子化效率和响应信号,改善了目标物峰形,有利于提高方法的灵敏度和选择性.图2 5种农药的基质标准溶液图谱(5 0.0gL-1)F i g.2 C h r o m a t o g r a mf o rm a t r i xs t a n d a r ds o l u t i o no f 5p e s t i c i d er e s i d u
19、 e s(5 0.0gL-1)2.2 提取剂优化选取茶叶空白样品,按1 0 0gk g-1浓度水平进行样品加标回收试验,以乙腈、甲醇、丙酮等有机溶剂作为提取剂,比较分析了3种溶剂的提取效率.试验发现:以丙酮和甲醇为提取剂时,浸提出的杂质较多,提取液比较浑浊,不利于后续净化,导致基质效应比较严重.乙腈极性大、穿透性强,通过盐析法除掉茶叶中的色素、蛋白质和糖分等大部分杂质,茶叶提取液颜色更加澄清,极大地减弱基质干扰,因此选用乙腈.由于这5种农药均为正离子模式电离,在酸性条件下响应值较高,故选用乙酸+乙腈(体积比19 9)溶液作为提取剂.另外,茶叶样品加适量水使其充分润湿溶胀后,可以提高提取效率.2
20、.3 净化方式选择在传统Q u E C h E R S方法中,主要以P S A、C1 8和G C B等为净化吸附剂.P S A利用阴离子交换吸附蛋白质、糖类和极性较高的物质,C1 8主要用于吸附脂肪和脂类等非极性干扰物,G C B常作为弱极性或非极性吸附剂来除去色素和甾醇等疏水性化合物.试验先用未经净化的绿茶、红茶、白茶和黑茶空白基质提取液直接配制了5 0gL-1农药的混合基质溶液,分别用传统的Q u E C h E R S净化法和m-P F C柱净化法处理上述配制的混合基质溶液后上机检测.对照实验则用前处理净化后的茶叶空白基质溶液直接配制5 0gL-1混合溶液一起上机检测,比较分析了两种净化
21、方法的萃取净化效果和回收率.试验发现,5种农药的回收率均高于7 5%,且m-P F C法回收率均略高于Q u E C h E R S法.Q u E C h E R S法降低了目标物回收率可能是由于净化填料中的G C B对具有平面环状结构的化合物具有很强的吸附性,在吸附除去茶叶提取液中色素的同时也吸附了均具有环状结构的5种待测目标物,导致回收率降低.据相关研究1 0-1 6,MWC NT s是一种纳米级中空材料,不仅结构独特且具有不同的电子、化学性能和高比表面积,表面键合不同的官能团或配合物,改善其溶解性和分散性,使其能够改善分散固相萃取对基质干扰化合物的去除效果,常用其替代G C B去除基质中
22、天然色素、固醇类和生物碱等大分子干扰物,对茶叶中杂质如色素、有机酸和茶多酚等吸附容量更大,吸附能力更强,还能改善对平面环状结构的吸附问题.Q u E C h E R S净化包净化法移取上清液振摇净化后需要再次离心,而m-P F C柱采用注射器式设计,净化过程不需旋涡振荡和离心,每一批次样品(1 6个)前处理时间可控制在2 0m i n以内,比Q u E C h E R S净化管操作更加简便.MWC NT s和P S A配合使用提高了净化效率和回收率,有效降低了基质中杂质的干扰.综合净化效果和提取效率,后续试验选取m-P F C柱净化.2.4 基质效应的影响基质效应(M a t r i xe f
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