白藜芦醇抑制肾纤维化减轻单侧输尿管梗阻诱导的肾损伤.pdf
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1、医学分子生物学杂志,2024,21(2):146-153 J Med Mol Biol,2024,21(2):146-153DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.02.009资助项目:重庆市大足区科技发展项目(No.DZKJ2023JSYJ-KWXM1031)通讯作者:宋亚玲(电话:15102322381,E-mail:)This work was supported by a grant from the Chongqing Dazu District Science and Technology Development Project(No.DZKJ2023J
2、SYJ-KWXM1031)Corresponding author:SONG Yaling(Tel:86-15102322381,E-mail:)白藜芦醇抑制肾纤维化减轻单侧输尿管梗阻诱导的肾损伤詹宏义,宋亚玲,贺绍林,周杨洋重庆市大足区人民医院血透室 重庆市,402360【摘要】目的 研究白藜芦醇抑制肾纤维化对单侧输尿管梗阻诱导的肾损伤的减轻作用及相关机制。方法 以 Sprague-Dawley(SD)大鼠和成纤维细胞 NRK-49F 为实验对象,分别进行体内研究和体外验证,体内:SD 大鼠行单侧输尿管梗阻诱导建立 TIF 大鼠模型,将大鼠随机分为 4 组(假手术+空白组、假手术+白藜芦醇组
3、、模型+空白组和模型+白藜芦醇组),每组 12 只大鼠。体外:将 NRK-49F 细胞用重组 TGF-1(5 ng/mL)或白藜芦醇(10 和 100 mol/L)处理后随机分为 4 组(对照组、TGF-1 组、TGF-1+白藜芦醇低剂量组和 TGF-1+白藜芦醇高剂量组)。Massons 染色检测肾脏中总胶原蛋白沉积;免疫组织化学染色检测组织中 E-cadherin、GFAP 和 Ki67 阳性细胞的表达;免疫荧光染色检测细胞中 Ki67 阳性细胞的表达;蛋白质印迹检测组织中 E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Rac1、c-Myc、Bcl-2、Cyclin D1、
4、-SMA、型胶原和型胶原的表达。结果 与对照组比较,白藜芦醇可以抑制大鼠体内单侧输尿管梗阻(unilater-al ureteral obstruction,UUO)肾脏中总胶原蛋白的过度沉积,下调-SMA 阳性成肌纤维细胞减少波形蛋白、型和型胶原,抑制 Rac1、GFAP 和 N-cadherin 的上调以及 E-cadherin 的下调;与假手术组比较,白藜芦醇可显著降低 UUO 大鼠中 Ki67 阳性细胞比率,并抑制 c-Myc,Bcl-2 和 cyclin D1 的表达;白藜芦醇抑制体内增殖相关途径 Wnt/-catenin 的激活;体外实验表明白藜芦醇治疗可减少成纤维细胞和 TECs
5、 的增殖,从而抑制 TGF-1 介导的表型转化和 ECM 积累。结论白藜芦醇通过抑制 Wnt/-catenin 通路的活性,抑制成肌纤维细胞的积累,并减轻了肾小管间质纤维化。【关键词】慢性肾病;白藜芦醇;单侧输尿管梗阻;肾小管间质纤维化;细胞外基质;Wnt/-catenin 通路【中图分类号】R692.6Resveratrol Inhibits Renal Fibrosis and Reduces Kidney DamageCaused by Unilateral Ureteral ObstructionZHAN Hongyi,SONG Yaling,HE Shaolin,ZHOU Yangy
6、angHemodialysis Room,Chongqing Dazu District People s Hospital,Chongqing,402360,China【Abstract】Objective To investigate the effect of resveratrol on renal fibrosis and kidney dam-age induced by unilateral ureteral obstruction and its related mechanism.Methods Sprague-dawley(SD)rats and NRK-49F fibro
7、blasts were used as experimental subjects for in vivo study and in vitrovalidation.In vivo,TIF rat model was establish by surgery to induce the unilateral ureteral obstruc-tion in SD rats,and the rats were then randomly divided into 4 groups:sham operation+blankgroup,sham operation+resveratrol group
8、,model+blank group and model+resveratrol group,12rats in each group.In vitro:NRK-49F cells were treated with recombinant TGF-1(5 ng/mL)orresveratrol(10 and 100 mol/L)and randomly divided into 4 groups:control group,TGF-1group,TGF-1+resveratrol low-dose group and TGF-+resveratrol high-dose group.Mass
9、on sstaining was used to detect total collagen deposition in the kidney.Immunohistochemical staining wasused to detect the expression of E-cadherin,GFAP and Ki67 in the tissues.Immunofluorescencestaining was used to detect the expression of Ki67 in cells.Western blotting was used to detect theexpres
10、sion level of Vimentin,N-cadherin,Racl,c-Myc,Bcl-2,Cyclin D1,-SMA,type I col-lagen and type collagen,E-cadherin.Results Resveratrol could inhibit the excessive depositionof total collagen in kidneys of UUO rats,down-regulate-SMA-positive myofibroblasts,reduce theexpression of vimentin,type I and typ
11、e collagen,and inhibit the up-regulation of Rac1,GFAPand down-regulation of N-cadherin.Resveratrol could significantly reduce the ratio of Ki67-positivecells in UUO rats and inhibit the expression level of c-Myc,Bcl-2 and cyclin D1.Resveratrol inhibi-ted the activation of proliferation-related pathw
12、ay Wnt/-catenin.The in vitro experimentsshowedthat resveratrol treatment could reduce the proliferation of fibroblasts and TECs,thereby inhibitingTGF-1-mediated phenotypic transformation and ECM accumulation.ConclusionResveratrol in-hibits the activity of Wnt/-catenin pathway and the accumulation of
13、 myofibroblasts,and reducesrenal tubulointerstitial fibrosis.【Key words】chronic kidney disease;resveratrol;unilateral ureteral obstruction;renal tubuleinterstitial fibrosis;extracellular matrix;Wnt/-catenin pathway 慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)的特征是肾功能不全,是公认的主要公共卫生问题,在世界范围内发病率和死亡率很高,约占人口的10%13%1。C
14、KD 隐蔽性强,疾病早期没有明显的临床症状。CKD 的治疗包括原发病的治疗和对症治疗,目标是延缓肾脏病的进展2-3。目前还没有可以进行根治该病的特效药物,因此,寻找有效减缓并改善 CKD 的药物是该领域研究的热点问题。白藜芦醇是多酚类化合物,主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物,具有抗氧化、抗炎和抗癌特性4。最近的研究表明,白藜芦醇通过多种生长因子、细胞因子和多种细胞信号通路抵抗心脏纤维化,或通过 MAPK/AP-1 通路调节 miR-21 抑制肺纤维化,这表明白藜芦醇作为人类潜在的抗纤维化剂具有研究价值5-7。此外,白藜芦醇还抑制血管平滑肌细胞重塑以及心脏成纤维细胞的生长和增殖
15、8。但是,关于白藜芦醇在肾脏抗纤维化作用方面的潜在机制还不完全清楚。在本研究中,使用大鼠体内单侧输尿管阻塞(unilat-eral ureteral obstruction,UUO)模型和 TGF-1 刺激的间质成纤维细胞研究白藜芦醇是否通过减少成肌纤维细胞积累而发挥抗纤维化作用以及肾小管间质纤维化的程度,并研究其相关机制,旨在为CKD 的缓解与治疗提供思路和策略。1 材料与方法1.1 实验材料48 只6 至8 周龄大的 Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,体重(200 20)g,购自重庆医科大学,使用许可证号:SCXK(渝)2022-0010。根据 3R原则给予动物人道关怀,经我院
16、动物管理伦理委员会讨论通过。正常大鼠肾 TEC(NRK-52E,RRID:CVCL_0468)和成纤维细胞(NRK-49F,RRID:CVCL_2144)购自中国科学院(中国上海)。主要试剂:白藜芦醇(上海碧云天生物技术有限公司,批号 20120330);DMEM 培养基(In-vitrogen,CA,美 国);DMSO(Sigma,中 国 上海);TGF-1(美国 PeproTech 生物公司,批号0312209-1);异氟烷(RWD Life Science,深圳,中国);BCA 试剂盒说明(上海碧云天生物技术有限公司);肝肾脏组织蛋白提取试剂盒购自 Pro-mega 公司;试验所用抗体均
17、购自上海艾博抗生物科技有限公司。主要仪器:DFC420C5M 数字显微镜相机(德国 Leica Microsystems);显微镜(Leica,德国)。1.2 动物模型建立符合美国国立卫生研究院(NIH 出版物 85-23出版,1996 年修订)的 实验动物的护理和使用指南 和研究方案(wydw2016-0030)的动物护理均已获得本院伦理委员会审核批准。据报道,动物研究符合 ARRIVE 指南(2010 年)以及英国药理学杂志的建议。将大鼠饲养在温度(22 25),湿度(40%60%)和光照(12 h 暗/12 h 光)控制的环境中,并喂养标准大鼠食物和水。在进行实验的前一天将大鼠禁食。将所
18、有大鼠随机分为 4 组:假手术+空白组、假手术+白藜芦醇组、模型+空白组和模型+白藜芦醇组,每组 12 只大鼠。用异氟烷麻醉大鼠,参照文献 9 进行 UUO 手术,于大鼠腋后线从左肋下向尾部方向剪开皮肤,钝性分离皮下组织及肌层,暴露左肾,沿肾蒂向肾下极方向寻找输尿管,在输尿管上段行双线结扎,并于结扎部分剪断输尿管,逐层缝合。假手术+空白组和假手术+白藜芦醇组只分离左侧输尿管不结扎。假手术+白藜芦醇组和模型+白藜芦醇组灌胃白藜芦醇(每天 20 mg/kg),假手术+空白组和模型+空白组灌胃等量生理盐水,根据先前研究的方案连续给药 7 d10。以 0.9%NaCl 作为口服载体。白藜芦醇治疗 7
19、d 后,每组大鼠用异氟烷麻醉,并通过741医学分子生物学杂志,2024,21(2):146-153 J Med Mol Biol,2024,21(2):146-153颈脱位法处死,收集肾组织作进一步检查。1.3 组织病理学检查将 1.2 中的肾脏组织固定在福尔马林中,并包埋在石蜡中,然后切成 4 切片,并用 Masson s染色。运用 DFC420 C 5 M 数字显微镜相机拍摄照片。参照文献 11 对间质胶原沉积的程度进行分级。1.4 细胞培养与处理将NRK-52E 和NRK-49F 细胞保存在添加了10%FBS,100 U/mL 青霉素和 100 g/mL 链霉素的DMEM 培养基中。将
20、NRK-52E 和 NRK-49F 细胞接种到含有 10%FBS 的完全培养基中,直到达到约70%融合为止,用于体外实验。24 h 后,将完整培养基替换为无血清培养基,将细胞孵育24 h,然后用重组 TGF-1(5 ng/mL)或白藜芦醇(10 和100 mol/L),细胞随机分为 4 组:对照组、TGF-1 组、TGF-1+白藜芦醇低剂量组和 TGF-1+白藜芦醇高剂量组。细胞实验中使用的白藜芦醇溶解于 DMSO 中。在对照组中,仅用 0.9%NaCl 处理细胞。1.5 免疫组织化学染色将肾脏组织用二甲苯脱蜡并使用梯度的乙醇体积(100%、95%、85%和75%)和蒸馏水进行水合,然后切成
21、4 m 厚的切片。内源性过氧化物酶被3%过氧化氢封闭。通过在0.1%柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中加热切片来进行抗原回收。使用抗 GFAP(1 200),抗 Ki67(1 100)和抗 E-cad-herin(1100)抗体通过免疫化学链霉亲和素-过氧化物酶法检测。通过显微镜(Leica)拍摄图像。两名独立研究人员以盲法对所有样品进行了半定量或定量评估。所使用的免疫相关程序符合 英国药理学杂志 的建议。1.6 免疫荧光染色参照文献 12 进行免疫荧光染色。简而言之,将细胞培养在盖玻片上,固定 4 m 厚的肾脏切片,用 0.5%Triton X-100 透化,并与抗 Ki67(1100)在4 过
22、夜,然后与 Alexa Fluor 488(In-vitrogen)偶联的二抗孵育。细胞用 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染以可视化细胞核。通过显微镜(Leica)拍摄图像。1.7 蛋白质印迹分析用 RIPA 提取肾组织,NRK-49F 和 NRK-52E细胞中的总蛋白。根据 BCA 试剂盒说明测量总蛋白浓度。蛋白质(30 50 g)在 8%12%SDS-PAGE 上分离并转移到 PVDF 膜上(美国马萨诸塞州密里波利市)。将膜在 TBST(10 mmol/L 的TrisHCl,150 mmol/L 的 NaCl 和 0.1%的 Tween20)中的 5%脱脂牛奶中于室温下封闭 1
23、 h。然后,将膜用一抗在 4 和结合 HRP 的二抗检测系统探测过夜。使用 SuperSignal West Pico 化学发光底物(Thermo Fisher Scientific)检测信号。将所有一抗稀释至 11 000,E-cadherin、型胶原、型胶 原、-SMA、Vimentin、N-cadherin、Rac1、c-Myc、Bcl-2、CyclinD1、Wnt、p-catenin、-cate-nin、TGF-1、TGF-1R。通过使用 Image-Pro Plus(6.0 版)测量信号强度并将其标准化为 GAPDH(18 000,BioWorld)抗体的信号来量化条带。1.8 统计
24、学处理使 用 SPSS 21.0(SPSS,Inc,Chicago,IL,USA)分析所有数据。测量数据表示为 x s。使用 LSD 方法比较成对比较。双向 Student s t检验用于分析两组之间的差异。比较两组以上时,使用具有 Bonferroni 校正的单向 ANOVA。仅当 P 0.05 且未发现方差显著不均匀时,才进行事后检验。2 结果2.1 白藜芦醇在体内对肌纤维母细胞表型的表达的影响与假手术+空白组比较,模型+空白组总胶原蛋白沉积升高(P0.05)。与模型+空白组比较,模型+白藜芦醇组总胶原蛋白沉积降低(P 0.05);与假手术+空白组比较,模型+空白组-SMA、型胶原和型胶原
25、蛋白表达水平升高(P0.05)。与模型+空白组比较,模型+白藜芦醇组-SMA、型胶原和型胶原蛋白表达水平降低(P0.05)(图 1)。2.2 白藜芦醇对间质纤维化的形成的影响与假手术+空白组比较,模型+空白组 E-cad-herin 蛋白表达水平降低(P0.05),Vimentin、N-cadherin 和 Rac1 蛋白表达水平升高(P 0.05)。与模型+空白组比较,模型+白藜芦醇组 E-cad-herin 蛋白表达水平升高(P0.05),Vimentin、N-cadherin 和 Rac1 蛋白表达水平降低(P 0.05);与假手术+空白组比较,模型+空白组 E-cadherin阳性细胞
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