叶绿体基因组分析技术在中药资源类专业实验教学中的应用.pdf
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1、收稿日期:通信作者:张朝凤,:基金项目:江苏省高等教育教学改革研究课题,编号 ;中国药科大学高层次人才引进经费项目 陈凌云叶绿体基因组分析技术在中药资源类专业实验教学中的应用陈凌云,答李穆,郑文芳,张朝凤中国药科大学中药学院(南京 )摘要近年来,叶绿体基因组数据被广泛用于解决植物系统发育问题和中药材鉴定,但我国高等院校中药资源类专业现有课程体系却普遍缺少叶绿体基因组学相关理论教学与实践教学环节。中国药科大学中药资源类专业实验教学使用第二代 测序数据,开展叶绿体基因组的组装、注释及系统进化分析的相关教学活动。实践证明,引入叶绿体基因组实验教学,有助于学生深入理解生物信息学在中药资源开发中的应用,
2、培养学生生物统计分析的能力。关键词叶绿体基因组;中药资源类实验;生物信息学 牞 牞 牞 牗 牞 牞 牞 牘 牶 牞 牞 牞 牞 牞 牶 牷 牷 近年来,中药资源相关研究取得了许多重要成果,尤其在药用植物基因组学分析方面。但国内高校中药资源类本专科生教学活动中,植物基因组学实践教学较少或处于空白状态;传统的中药资源相关学习活动以实物辨识和记忆背诵为主,围绕植物传统分类学与本草沿革等展开。为了提升中药资源与开发专业建设水平,促进学生掌握药用植物基因组学相关知识与技能,教学团队在中国药科大学中药资源类专业的实验教学中引入了叶绿体基因组的组装、注释及进化分析等实验内容。教学实践证明,该实验教学的实施有
3、助于学生深入理解生物信息学在中药资源开发中的应用,提升学生生物统计技术的实践能力。?植物基因组序列分析技术的现状 年美国能源部提出了“人类基因组计划”()草案 ,年 正式启动。年,科学家发表了拟南芥的全基因组序列信息 。截至 年 月,科学家已完成 多个被子植物物种的全基因组测序(:)。植物基因组学已被广泛应用于药用植物鉴定、繁殖育种、分类演化等研究。叶绿体基因组一药学教育 年 第 卷 第 期般是一个双链环状 ,独立于核基因组,在细胞中拷贝数较多,大小在 到 之间,存在于藻类和绝大多数的绿色植物细胞中。叶绿体基因组较为保守,含有大量功能基因,对于物种鉴定、分类、演化研究有着极为重要的作用。目前,
4、科研工作者普遍采用第二代测序平台获得植物基因组 数据,再通过算法提取叶绿体的小片段 序列(),拼接成片段(),再连接成完整的或者间断的长序列()。随着测序技术的发展,测序准确率提高,测序价格大幅下降,已完成叶绿体全基因组测序的物种数目正在爆发式增长。近年来,科学家相继报道了人参、三七、丹参等重要药用植物的全基因组序列,本草基因组学应运而生 ,对中药学发展产生了重要影响。例如,人参基因组数据的发表促进了人参育种和人参皂苷生物合成研究 ,黄花蒿的全基因组测序不仅发掘了与青蒿素合成相关的基因,而且使得通过异源基因表达增加青蒿素产量成为可能 ,冬虫夏草菌的全基因组测序使得虫草素的生物合成有了可靠的理论
5、基础 。植物基因组技术在中药学与药用植物学研究中发挥着重要作用,?叶绿体基因组分析技术的教学需求叶绿体基因组学在药用植物学与中药鉴定学相关的教学、研究中有着重要作用。目前,国内 药用植物学 教材 ,仍然采用恩格勒分类系统。而基于基因组学的分类系统如 ,相比恩格勒分类系统更为接近植物真实的进化历史,已经被国外教材和科研工作广泛采纳。在药用植物基源鉴定方面,基于基因组学的分子鉴定相比于形态和显微鉴别更加高效、准确,但中药资源类专业本专科教学实践却较少提及相关技术。为了提升中药资源类专业教育教学水平,医药院校需在中药鉴定学、药用植物学等理论课程和实验课程中增加叶绿体基因组分析相关内容。实验的开设一方
6、面有益于培养学生科研思维,提高学生的实验操作技能;另一方面能够充分调动学生的学习积极性,拓宽学生科研视野。当前,部分高校(如北京协和医学院、武汉理工大学、上海中医药大学等)面向本专科生或研究生已开展了基因组学相关课程教学,但大部分中医药类高校尚无植物基因组学相关教学内容。网络技术的普及,大大降低了基因组学实验教学成本,面向本专科学生开展基因组学相关实践教学成为可能。开展基因组学实验教学,需要的计算机条件如下:以上或 以上,以上的可用运行内存空间,以上的可用硬盘空间。处理器的性能和线程数量主要影响运行速度,近十年来市售的服务器几乎都能满足本实验的需求。叶绿体基因组的组装在 系统上完成,注释和系统
7、进化分析可以在 系统,也可以在 系统上完成。笔者采用的服务器品牌和配置如下:、两 颗、内存、操作系统。主要软件为:、。?叶绿体基因组分析技术的教学案例以西南山梗菜的第二代测序数据为实验材料,笔者设计了叶绿体基因组的分析实验。在知识体系和内容上该实验考虑了学生综合运用知识、解决和探索科学问题的能力,让学生了解和掌握植物基因组学知识。如果学生没有接触过 系统,可能较难完成本实验内容。因此,在开展本实验前,笔者建议用 个课时向学生讲授 相关知识,或让学生自学相关知识。对多个叶绿体基因组进行序列比对并构建系统进化树是教学过程中的主要难点,需要教师在讲解这些内容时更为细致。完成本实验全部流程需要大约 小
8、时,约 个课时。西南山梗菜()属于山梗菜科,半边莲属,又名野烟,小烟草。记载于 滇南本草:“味辛、麻,性温,有大毒(:)。现代药理研究认为,西南山梗菜有消炎止痛、解毒、杀虫止痒的功效。常用于治疗热毒疮痈、跌打损伤、风湿性关节炎等病症。本实验西南山梗菜采集于重庆市梁平区曲水镇聚宝村(年 月,图 ),种植于中国药科大学药用植物园。笔者取西南山梗菜的叶片送天津诺禾致源科技有限公司使用 平台测序,测序数据用于后续叶绿体基因组组装与分析。实验教学基本流程如图 。?实践过程 叶绿体基因组组装实验使用 软件对原始测序数据去除接 头 和 低 质 量 。从 :?获取并安装。也可以使用 (:药学教育 年 第 卷
9、第 期 )安 装 。在 官 网 下 载 的 系统的安装包,上传到服务器后,使用 指令执行即可。安装完成后,使用 安装 软件。图 实验所用的实验材料 西南山梗菜图 实验教学的基本流程 的执行命令如下:指令需要输入经双末端测序得到的 个数据,并指定输出的 个文件的名称。指定名称后,该指令可 以 支 持 多 个 参 数,以 设 定 执 行 的 步 骤。“”为 软件包自带的一个包含接头序列的文件。“”代表切除与接头序列和反向序列匹配的质量值小于 的 ,“”代表切除与接头序列相匹配的 的最小质量值。“”,从 起始开始切除碱基,“”代表切除质量值小于 的碱基。“”,从 末端开始切除碱基,参数含义同上。“”
10、,划窗剪切,会以窗口扫描过整个 ,再按照窗口切除碱基。“”代表窗口的大小为 个碱基,“”代表如果这一条 的窗口的平均质量值低于 ,则删除一整条 。“,设定 的最小长度。“”代表切除总长度低于 的 。此步骤大约需要 分钟,产生的 个 文件将用于下一步分析。采用 软件进行叶绿体基因组的组装,软 件 从 :下载,并按照说明书安装。也可以在 中使用指令 完成 的安装。采用如下命令执行叶绿体基因组组装:,各项参数,“”和“”表示正向和反向的测序数据,“”表示需要组装的基因组类型,“”代表输出的结果文件夹的名称,“”代表使用的线程数,“”代表组装时的 长度。在多数组装中,“”设定为 和 能取得较好的结果。
11、默认软件参数下,将自动估计组装需要的 数量。可以添加 参数来设置使用 的数据,但需要注意,会将全部的测序数据一次性写入内存,所以此项需要谨慎设置。结果为一个文件夹,其内容如图 。图 输出的结果从上至下,第一个文件夹为 的输出数据,的组装核心采用的是 ,文件药学教育 年 第 卷 第 期夹内含有上述所设定的不同 的组装结果。第二个文件夹为参考基因组库。第三到第四个文件为 产生的完整的、环装的基因组序列。由于同一个植物的叶绿体基因组存在一定差异的拷贝,因此会有含有编号 、的两个序列,挑选其中一个用于后续分析。第五个文件即为最终结果。第六到第九文件为使用 比对到参考基因组后,能成功匹配的 。第十到第十
12、二个文件是没有去除非成环或非主 链序列的组装结果。(如果最终结果未成环,需要用第十到第十二个文件进行进一步分析)。最后一个文件是运行日志,记录了组装的主要过程。将图 后缀为 的文件导入到软件 。(:)是一个可视化的基因组修改软件,能够直观地分析前述组装的结果。使用 导出一段大单拷贝区,一段小单拷贝区和重复拷贝区的两个部分,也可以得到最终组装结果。在测序数据不完整,测序错误、测序污染未去除或去除不完全等情况下,有可能得到类似如图 的结果,是 ,区别于图 的 ,只能得到叶绿体基因组的大片段。图 由 可视化完整的组装结果图 由 可视化不完整的组装结果不完全组装的叶绿体基因组也能用于许多研究,如系统进
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