胰岛素样生长因子1基因转染骨髓间充质干细胞对骨折愈合及血管形成的作用研究.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(3):217-223 J Med Mol Biol,2024,21(3):217-223DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.03.005资助项目:海南省自然科学基金(No.822RC852)通讯作者:陈余兴(电话:[phone],E-mail:)This work was supported by a grant from the Natural Science Foundation of Hainan Province(No.822RC852)Corresponding author:CHEN Yuxing(Tel:[phone],E-mail:)胰岛素样生长因子 1 基因转染骨髓间充质干细胞对骨折愈合及血管形成的作用研究王贵,黎尊成,刘景新,陈余兴海南西部中心医院骨科 海南省儋州市,571700【摘要】目的 探究胰岛素样生长因子 1(insulin-like growth factor 1,IGF1)基因转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)对大鼠骨折愈合及血管形成的影响。方法 建立大鼠股骨骨折模型,采用 BMSC、含 IGF1 基因慢病毒转染的 BMSC 分别处理模型大鼠。X 线影像系统、micro-CT 扫描仪观察骨折愈合情况,HE 染色观察股骨组织病理学变化,免疫荧光染色观察血管内皮标记物 CD31 表达,蛋白质印迹检测骨形态发生蛋白 2(BMP-2)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)与血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)表达。结果 与模型组比较,BMSC 组与 IGF1-BMSC 组大鼠的骨折线模糊,有愈合性骨痂形成,BMD、BV/TV 升高(P 0.05),Tb.N 增加(P 0.05),Tb.Sp 降低(P 0.05),CD31 荧光表达增强,BMP-2、OPN、OCN 及 VEGF、Ang-1 蛋白相对表达量均上调(P0.05)。与 BMSC 组比较,IGF1-BMSC 组大鼠骨折线几乎消失,愈合效果更佳,BMD、BV/TV 升高(P 0.05),Tb.N 增加(P0.05),Tb.Sp 降低(P0.05),CD31 荧光表达更强,BMP-2、OPN、OCN 及 VEGF、Ang-1 蛋白相对表达量也进一步上调(P0.05)。结论 IGF1 基因转染 BMSC 能够有效促进大鼠股骨骨折愈合,加速血管形成,且效果优于 BMSC 单独作用。【关键词】骨折;骨髓间充质干细胞;胰岛素样生长因子 1;骨折愈合;血管形成【中图分类号】R683Effect of Insulin-like Growth Factor 1 Gene Transfected Bone Mar-row Mesenchymal Stem Cells on Fracture Healing and AngiogenesisWANG Gui,LI Zuncheng,LIU Jingxin,CHEN YuxingDepartment of Orthopedics,Hainan Western Central Hospital,Danzhou,Hainan,571700,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of insulin-like growth factor 1(IGF1)genetransfected bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)on fracture healing and angiogenesis inrats.MethodsThe rat femoral fracture model was established,and the BMSCs with or withoutIGF1 gene transfection were used to treat the rats.X-ray imaging system and micro-CT scanner wereused to observe the fracture healing.HE staining was used to observe the histopathological changes offemur.Immunofluorescence staining was used to observe the expression of vascular endothelial mark-er CD31.Western blotting was used to detect the expression levels of bone morphogenetic protein 2(BMP-2),osteopontin(OPN),osteocalcin(OCN),vascularendothelialgrowthfactor(VEGF)and angiopoietin-1(Ang-1).ResultsWhen compared with those in the model group,the fracture lines of the rats in the BMSC group and the IGF1-BMSC group were blurred and the for-mation of healing callus was observed,the values of BMD and BV/TV were increased(P0.05),the value of Tb.N was increased(P0.05),the value of Tb.Sp was decreased(P0.05),theCD31 fluorescence expression was enhanced,the relative protein expression levels of BMP-2,OPN,OCN,VEGF and Ang-1 were all up-regulated(P 0.05).When compared with those inthe BMSC group,the fracture line of rats in the IGF1-BMSC group was almost disappeared,andthe healing effect was better,the values of BMD and BV/TV were increased(P0.05),the val-ue of Tb.N was increased(P0.05),the value of Tb.Sp was decreased(P0.05),and CD31fluorescence expression was stronger in the IGF1-BMSC group,the relative protein expression levelsof BMP-2,OPN,OCN,VEGF and Ang-1 were further up-regulated(P 0.05).ConclusionIGF1 gene transfection with BMSC can effectively promote femoral fracture healing and acceleratevascular formation in rats,and the effect is better than that of BMSC alone.【Key words】fracture;bone marrow mesenchymal stem cell;insulin-like growth factor 1;fracture union;angiogenesis 骨折愈合是涉及一系列组织学和生化变化的复杂修复过程,由多种不同因素之间协调作用1。骨折部位周围的成骨和软骨细胞、炎症细胞、血液供应和细胞因子在整个骨折愈合过程中起着重要作用,其中,骨折断端周围血管形成对于骨折修复及正常愈合至关重要,当血管形成受到阻碍时,会导致骨折愈合延迟或抑制愈合2-3。尽管骨组织具有强大的自愈能力,但大约 5%10%的骨折患者在愈合过程中会受到一定程度的干扰,临床表现为骨折愈合延迟或者不愈合4,给患者和社会带来了巨大负担。近年来,基于间充质干细胞的治疗方法在恢复受损骨骼的结构和功能方面显示出较大优势。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)是一类具有较强的增殖能力、多向分化潜力及低免疫原性的间充质干细胞,在一定条件下可分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等,可作为促进骨折修复和骨再生的重要种子细胞5。然而,BMSC 植入体内后由于局部缺乏生长因子的刺激作用,其成骨效率较低,且细胞活力也大大下降6。为了克服这一问题,研究者们通过基因工程改造技术将特定类型的基因负载于 BMSC 上,以增强细胞谱系特异性成骨分化能力。胰岛素样生长因子 1(insulin-like growth factor 1,IGF1)是一种在血液中发现的激素,有助于成骨细胞的增殖,增强成熟成骨细胞的功能,并在刺激成骨细胞功能和骨形成中起作用7。本研究通过构建股骨骨折大鼠模型,并将 IGF1 基因转染至 BMSC 上,观察 IGF1 基因转染的 BMSC 对大鼠股骨骨折愈合及血管形成的影响,以期为骨折的临床治疗提供有价值的实验依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1实验动物实验使用 SPF 级雄性 SD 大鼠38 只,10 周龄,体质量为 270 290 g,由海南药物研究所有限责任公司提供。大鼠分笼饲养,期间供给标准饲料喂养,自由饮水、采食。在实验室内适应性喂养 1 周,温度为 22 24、相对湿度为 50%60%,光照 12 h/黑暗 12 h 交替,通风良好,定期进行紫外线消毒处理。1.1.2 主要试剂与材料大鼠 BMSC 购于武汉普诺赛生命科技有限公司,DMEM/F12 培养液购于南京维森特生物技术有限公司,嘌呤霉素购于北京索莱宝科技有限公司,Trizol 试剂盒购于日本 Taka-ra 公司,cDNA 第一链合成试剂盒和通用型高灵敏度染料法定量 PCR 检测试剂盒购于南京诺唯赞生物科技有限公司,RIPA 裂解液购于北京普非生物科技有限公司,BCA 蛋白测定试剂盒购于美国Thermo Scientific 公司,PVDF 膜购于美国 Millipore公司,克氏针购于上海浦东金环医疗用品有限公司,乙二胺四乙酸脱钙剂购于四川赛恩诺精细化学品有限责任公司,HE 染色、ECL 显色液及 DAPI染料购于上海碧云天生物研究所,OCT 包埋剂购于美国 Sakura 公司,抗体 IGF1、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨 钙 素(osteocalcin,OCN)与血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)、血管生成素-1(angiopoie-tin-1,Ang-1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、CD31及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG、Alexa Flu-or 488 标记的山羊抗兔 IgG 均购于英国 Abcam 公司,Lenti-NC-EGFP 慢病毒与 Lenti-IGF1-EGFP 慢病毒交由上海生工生物工程有限公司设计构建。1.2 负载 IGF1 基因的 BMSC 细胞系建立在分离的大鼠 BMSC 中加入 DMEM/F12 培养液,置于 37 5%CO2恒温箱内进行传代培养。取第 3 代 BMSC 接种于 6 孔板内,密度为每孔 5 104个,用阴性对照 Lenti-NC-EGFP 慢病毒、Lenti-IGF1-EGFP 慢病毒分别感染 BMSC,感染复数为50,在恒温箱内转染 48 h 后,使用嘌呤霉素筛选稳转细胞系,在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白表达,并采集图像。1.3 RT-qPCR 测定细胞内 IGF1 基因表达水平Trizol 法分别提取转染后 BMSC 与未转染 BM-SC 的总 RNA,具体步骤参照试剂盒说明书。在NanoDrop2000 上测定 RNA 浓度、纯度。使用 cD-812王贵,等.胰岛素样生长因子 1 基因转染骨髓间充质干细胞对骨折愈合及血管形成的作用研究NA 第一链合成试剂盒进行反转录,得到 cDNA。将获得的 cDNA 作为底物,根据 RT-qPCR 基因荧光定量检测试剂盒,配制 20 L 反应体系,依次加入反应底物与各试剂后,涡旋混匀,置于 ABI7500 型定量 PCR 检测系统上进行扩增,反应条件设为:95 5 min,95 30 s,一共 40 个循环;60 45 s,72 30 min。扩增结束后,采用2-Ct法进行分析,以 GAPDH 基因作为内参,计算目的基因 IGF1 的相对表达量。1.4 蛋白质印迹检测细胞内 IGF1 蛋白及股骨组织内成骨相关蛋白 BMP-2、OPN、OCN 与血管生成相关蛋白VEGF、Ang-1 表达水平 收集转染后 BMSC 与未转染的 BMSC,添加RIPA 抽提细胞总蛋白。将股骨组织碎化后,加入RIPA 抽提组织总蛋白。BCA 法测定蛋白浓度,进行蛋白变性处理,取等量 30 g 蛋白上样至 10%SDS-PAGE 凝胶孔内,电泳分离蛋白后转至 PVDF膜,将膜浸入 5%脱脂奶粉中室温封闭 1 h,经TBST 洗涤,加入稀释后的一抗(IGF1,1 2 000;BMP-2,12 000;OPN,1 2 000;OCN,1 2 000;VEGF,12 000;Ang-1,12 000),将膜与一抗液摇床上 4 孵育过夜。次日,除去一抗,膜经TBST 洗涤后,加入稀释后的辣根过氧化物酶标记的对应二抗(1 5 000),置于室温下再孵育 1 h。结束后,除去二抗,TBST 再次洗膜,滴加 ECL 显色液显色,成像系统采集图像,Image-Pro Plus 6.0软件分析各蛋白质条带灰度值,以 GAPDH 蛋白作为内参,计算各目的蛋白 IGF1、BMP-2、OPN、OCN、VEGF、Ang-1 的相对表达量。1.5 动物造模与分组处理参考文献 8 方法进行大鼠股骨骨折模型的构建。通过腹腔注射氯胺酮(75 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)将 30 只大鼠麻醉,常规备皮,碘伏消毒,从右股骨髁间窝处垂直穿入 1.0 mm 克氏针,至骨髓腔后拔出,折断股骨中段,接着将克氏针沿骨髓腔贯穿整个股骨,固定骨折,剪去多余克氏针,将针尾埋于骨皮质下,缝合伤口并消毒。通过 X 线影像系统观察大鼠股骨骨折情况,若股骨中段横形骨折、克氏针固定效果较好且无明显移位,则说明骨折模型构建成功。将造模成功的 24只 SD 大鼠按照随机数字表法分为模型组、BMSC组、IGF1-BMSC 组,每组8 只,另取8 只健康大鼠作为空白组,此组大鼠不进行任何处理。造模24 h后,BMSC 组大鼠将 5 104个 BMSC 悬液注射进入骨髓腔内,IGF1-BMSC 组将 5 104个转染 IGF1 慢病毒的 BMSC 悬液注射进入骨髓腔内,空白组和模型组同时注射等量 PBS。随后将各组大鼠继续置于动物实验室内分笼饲养。1.6 X 线影像系统观察骨折愈合情况4 周后,将各组大鼠麻醉处死,超净台剥离右股骨骨折标本,采用 X 线影像系统摄片观察股骨骨折愈合状态,曝光设置为 52 kV、3.2 mAs 和10.9 ms,采集图像并保存。1.7 micro-CT 扫描仪检测骨折愈合及骨指标使用 10 m 体素、79 kV、125 A 的 micro-CT扫描仪对骨折愈合与新骨形成进行观察评估,Recon 建 模 软 件 进 行 三 维 重 建,分 析 骨 密 度(BMD)、骨 体 积 分 数(BV/TV)、骨 小 梁 数(Tb.N)和骨小梁间距(Tb.Sp)等参数。检测后,对大鼠股骨骨折区域进行三维重建。1.8 HE 染色观察股骨组织病理学变化取各组大鼠股骨骨折上下各 5 mm 处组织,空白组取相同位置处的股骨组织,置于4%多聚甲醛中固定,乙二胺四乙酸脱钙剂脱钙。再经梯度酒精脱水、二甲苯透明后,常规石蜡包埋,沿断面连续切片,制备 5 m 厚的切片,进行 HE 染色,中性树胶封固,通过光学显微镜观察股骨组织病理学变化情况,并采集图像。1.9 免疫荧光染色观察股骨组织 CD31 表达将各组大鼠股骨骨折处组织进行固定、脱钙处理,OCT 包埋剂包埋,切成厚度约 5 m 的冷冻切片。切片通过梯度酒精脱水、二甲苯透明后,进行荧光免疫标记,滴加10%山羊血清,37 封闭50min。在切片上加入含兔抗人 CD31 单克隆抗体(1100),放于 4 孵育过夜。次日,取出切片,室温下复温,PBS 清洗,加入 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG 抗体(1200),湿盒内避光染色 2h。结束后 PBS 清洗,滴加 DAPI,再置于湿盒内避光染色 10 min。PBS 清洗,抗荧光淬灭封片剂封片,在荧光显微镜观察染色情况,并采集图像。1.10 统计学分析实验数据采用 SPSS24.0 进行统计学分析,Graphpad prism 8.30 绘制统计图,符合正态性的计量资料以平均数 标准差(x s)表示。采用ANOVA 方差分析进行多组间数据比较,组间两两比较采用 LSD-t 检验。2 结果2.1 BMSC 转染效果未转染的BMSC 无绿色荧光蛋白表达,转染NC 慢912医学分子生物学杂志,2024,21(3):217-223 J Med Mol Biol,2024,21(3):217-223病毒和IGF1 基因慢病毒的 BMSC 均可见大量绿色荧光蛋白表达,转染率分别为96.5%、98.0%(图1)。图 1 转染后 BMSC 内绿色荧光蛋白表达观察(荧光倒置显微镜,100)通过 RT-qPCR 和蛋白质印迹检测经过转染后BMSC 中 IGF1 的表达水平,检测结果显示,转染IGF1 基因慢病毒的 BMSC 中 IGF1 mRNA 的相对表达量与蛋白相对表达量均显著高于转染 NC 慢病毒的 BMSC 和未转染的 BMSC(P 0.05)(图2)。1:BMSC;2:NC-BMSC;3:IGF1-BMSC。与 BMSC 比较,P0.05;与 NC-BMSC 比较,#P0.05。图 2 转染后 BMSC 中 IGF1 表达水平比较2.2 各组大鼠骨折愈合情况比较X 线影像系统对各组大鼠股骨骨折愈合进行评估,空白组未见骨折线,模型组骨折线十分明显;与模型组比较,BMSC 组骨折线较模糊,IGF1-BM-SC 组骨折线几乎消失,IGF1-BMSC 组骨折愈合情况明显优于 BMSC 组(图 3)。图 3 各组大鼠股骨骨折愈合情况(X 线)2.3 各组大鼠骨组织形态、骨密度及相关计量学比较通过 micro-CT 3D 重建图像观察到模型组股骨骨折端矿化物分离,未见愈伤组织形成;与模型组比较,BMSC 组和 IGF1-BMSC 组骨痂矿化物连续,有愈伤组织形成,且 IGF1-BMSC 组愈合效果优于BMSC 组(图 4)。对各组大鼠 BMD 与骨形态计量相关指标进行检测发现,与空白组比较,模型组 BMD、BV/TV显著 降 低(P 0.05),Tb.N 显 著 减 少(P 0.05),Tb.Sp 显著升高(P 0.05);与模型组比较,BMSC 组和 IGF1-BMSC 组 BMD、BV/TV 显著升高(P 0.05),Tb.N 显著增加(P 0.05),Tb.Sp 显著降低(P 0.05);与 BMSC 组比较,IGF1-BMSC 组 BMD、BV/TV 显 著 升 高(P 0.05),Tb.N 显著增加(P0.05),Tb.Sp 显著降低(P0.05)(表 1)。022王贵,等.胰岛素样生长因子 1 基因转染骨髓间充质干细胞对骨折愈合及血管形成的作用研究图 4 各组大鼠股骨形态观察(micro-CT 3D 重建)表 1 各组大鼠 BMD、BV/TV、Tb.N 及 Tb.Sp 比较(x s,n=8)组BMD(g/cm3)BV/TVTb.N(1/mm)Tb.Sp(mm)空白组0.32 0.030.45 0.043.48 0.460.15 0.01模型组0.18 0.020.21 0.021.50 0.170.29 0.03BMSC 组0.25 0.02#0.30 0.03#2.16 0.23#0.22 0.02#IGF1-BMSC 组0.30 0.03#&0.41 0.04#&3.08 0.31#&0.16 0.02#&注:与空白组比较,P0.05;与模型组比较,#P0.05;与 BMSC 组比较,&P0.05。2.4 各组大鼠股骨组织病理变化观察结果通过 HE 染色观察到空白组大鼠股骨组织结构完整,骨小梁连接性好;模型组大鼠股骨组织骨小梁较为细小,边缘骨吸收活跃,成骨细胞较少,并有大量炎症细胞浸润;与模型组比较,BMSC 组和IGF1-BMSC 组有较多骨性骨痂,骨小梁增粗,且IGF1-BMSC 组愈合情况优于 BMSC 组,成骨细胞数量增多(图 5)。图 5 各组大鼠股骨组织病理学变化(HE 染色,100)2.5 各组大鼠股骨组织中 CD31 表达比较免疫荧光染色观察股骨组织内血管形成标记物CD31 表达情况,与空白组比较,模型组 CD31 荧光表达明显减弱;而相较于模型组,BMSC 组和 IGF1-BMSC 组 CD31 荧光表达增强,同时,IGF1-BMSC 组CD31 荧光表达要明显强于 BMSC 组(图6)。图 6 各组大鼠股骨组织中 CD31 表达检测(免疫荧光染色,100)122医学分子生物学杂志,2024,21(3):217-223 J Med Mol Biol,2024,21(3):217-2232.6 各组大鼠股骨组织中成骨相关蛋白及血管生成相关蛋白表达比较 采用蛋白质印迹检测了各组大鼠股骨组织中成骨相关蛋白 BMP-2、OPN、OCN 与血管生成相关蛋白 VEGF、Ang-1 的表达水平,与空白组比较,模型组 BMP-2、OPN、OCN 及 VEGF、Ang-1 蛋白相对表达量均显著下调(P0.05);与模型组比较,BMSC 组和 IGF1-BMSC 组 BMP-2、OPN、OCN 及VEGF、Ang-1 蛋白相对表达量均显著上调(P 0.05);此外,与 BMSC 组比较,IGF1-BMSC 组BMP-2、OPN、OCN 及 VEGF、Ang-1 蛋白相对表达量均进一步显著上调(P0.05)(图 7)。1:空白组;2:模型组;3:BMSC 组;4:IGF1-BMSC 组。与空白组比较,P 0.05;与模型组比较,#P 0.05;与 BMSC 比较,&P0.05。图 7 各组大鼠股骨组织中成骨相关蛋白与血管生成相关蛋白表达水平3 讨论目前,对于迟发性愈合或非愈合骨折,常采用自体和血管化骨移植进行骨修复治疗,然而,该疗法通常费用昂贵,供体组织短缺,且对部分患者无效9。近年来,干细胞移植已成为治疗骨折的替代选择。通过将 BMSC 移植到骨折区域骨髓腔内,在一定的诱导条件下,其可以向成骨和软骨方向分化,增加骨细胞数目,达到骨折后组织修复的作用。尽管如此,BMSC 的应用仍然受到免疫排斥、成骨率低、存活率低等因素限制,因此,提高 BM-SC 在骨折部位的成骨能力与存活率对于骨折治疗意义重大。BMSC 的成骨分化能力与多种因素密切相关,现代医学对其促分化相关因子进行了积极探索,并发现通过将促成骨分化因子转入 BMSC 中,可以明显提高 BMSC 的成骨能力,这为骨组织疾病的治疗提供了创新性策略。目前,已有研究将 IGF1 基因转染至 BMSC 并应用于骨性关节炎大鼠治疗中,结果显示,经 IGF1 基因转染的 BMSC 能有效改善骨性关节炎大鼠的病理损伤,促进膝关节损伤修复10。本研究通过将 IGF1 基因转染的 BMSC 注射到股骨骨折大鼠的骨髓腔内后,观察到大鼠骨折线几乎消失,骨愈合效果好,BMD、BV/TV 升高,Tb.N 增加,Tb.Sp 降低,这些结果均表明 IGF1 基因转染 BMSC 能够促进大鼠股骨骨折愈合。BMP-2 是机体主要的骨形态发生蛋白,能刺激DNA 合成和细胞复制,促进 BMSC 向成骨细胞分化,扩大成骨细胞增殖,诱导机体内部软骨和骨的形成,参与骨折愈合过程11。OPN 是一种在成骨细胞中合成的骨基质蛋白,通常在成熟成骨细胞的骨形成过程中表达,可以刺激成骨细胞的粘附、增殖和钙化,并介导机械应力引起的骨代谢变化12。OCN 是骨骼中最丰富的蛋白质之一,也是成骨细胞中特异性表达的标志物,通常用作骨形成标志物13。本研究结果显示,IGF1 基因转染的 BMSC治疗的大鼠股骨组织中 BMP-2、OPN、OCN 蛋白表达水平明显高于未经转染的 BMSC 治疗的大鼠,由222王贵,等.胰岛素样生长因子 1 基因转染骨髓间充质干细胞对骨折愈合及血管形成的作用研究此说明,IGF1 基因转染提高了 BMSC 在股骨骨折大鼠中的成骨能力。成骨和血管生成在骨形成过程中高度耦合,血管形成是骨组织再生的先决条件。在骨组织工程中,BMSC 不仅直接分化成内皮细胞参与骨缺损区域的新血管形成,而且还分泌血管生成因子如VEGF 和 Ang-1,以促进局部血管形成14-15。本研究通过检测血管形成标志物 CD31 与 VEGF、Ang-1蛋白表达发现,经过 IGF1 基因转染的 BMSC 治疗的大鼠股骨组织中 CD31 荧光表达要明显强于 BM-SC 单独治疗的大鼠,VEGF 与 Ang-1 蛋白表达水平也较高,这一结果提示,IGF1 基因转染提高了BMSC 促进了股骨骨折大鼠中血管形成,有利于骨折愈合。综上所述,本研究表明 IGF1 基因转染能够提高 BMSC 形成组织工程骨的能力,刺激成骨因子表达,增加血管形成,进一步促进大鼠的股骨骨折愈合,这为骨折的临床治疗奠定了实验基础。但关于IGF1 促进 BMSC 成骨分化的具体机制,以及其直接通过 BMSC 还是其他途径促进骨折愈合和血管生成的,有待后续进一步研究。参考文献1 HELLWINKEL J E,WORKING Z M,CERTAIN L,et al.The intersection of fracture healing and infection:Ortho-paedics research society workshop 2021 J.J OrthopRes,2022,40(3):541-552.2MICK P,FISCHER C.Delayed fracture healingJ.Se-min Musculoskelet Radiol,2022,26(3):329-337.3WANG C,YING J,NIE X,et al.Targeting angiogenesisfor fracture nonunion treatment in inflammatory diseaseJ.Bone Res,2021,9(1):29.4PANTELI M,VUN J S H,POUNTOS I,et al.Biologicaland molecular profile of fracture non-union tissue:A sys-tematic review and an update on current insightsJ.JCell Mol Med,2022,26(3):601-623.5 PURWANINGRUM M,JAMILAH N S,PURBANTORO SD,et al.Comparative characteristic study from bone mar-row-derived mesenchymal stem cellsJ.J Vet Sci,2021,22(6):e74.6 LIN H,SOHN J,SHEN H,et al.Bone marrow mesenchy-mal stem cells:Aging and 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