铜藻岩藻多糖匀浆提取工艺及抗氧化活性分析.pdf

基金项目:厦门市海洋与渔业发展专项资金(.)自然资源部第三海洋研究所基本科研业务费专项资金资助项目(.)福建省科技计划项目(.)厦门市科技计划项目(.)作者简介:蔡树芸女硕士生研究方向:中药化学与分析:.通信作者:张怡评男博士研究员研究方向:海洋中药资源研究与开发:.铜藻岩藻多糖匀浆提取工艺及抗氧化活性分析蔡树芸骆春萍许敏何袅袅黄雅瑜林米妮张怡评(.福建中医药大学药学院福建 福州.自然资源部第三海洋研究所海洋生物资源开发利用工程技术创新中心福建 厦门.厦门海洋职业技术学院海洋生物学院福建 厦门.福建省海岛资源生态监测与保护利用重点实验室福建 福州)摘要:目的 优化铜藻岩藻多糖的匀浆提取工艺并测定其抗氧化活性 方法 以岩藻多糖的提取率为指标基于单因素试验的基础上采用响应面法对铜藻中岩藻多糖的提取工艺进行优化并对其抗氧化活性进行验证结果 最佳提取工艺条件为提取时间 、提取温度 、液料比 和提取次数 次 在此条件下多糖的提取率为.抗氧化活性研究结果表明铜藻岩藻多糖在质量浓度为.范围内有一定的抗氧化活性对 自由基、自由基清除率的 分别为.、.结论 该提取工艺高效可为铜藻岩藻多糖的制备及应用提供理论依据关键词:铜藻岩藻多糖匀浆法提取工艺响应面抗氧化活性中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):.:药学研究 .铜藻()又名柱囊马尾藻、草茜、海柳麦等隶属于褐藻门墨角藻目马尾藻科马尾藻属是马尾藻属中个体较大的可食用大型褐藻通常长度可达 新华本草纲要中记载了福建民间以铜藻作中药“海藻”药用其味咸、性寒归肺肝经 它具有消痰软坚、清热利水的功效可用于治疗瘿瘤、瘰疬、水肿、甲状腺肿以及淋巴结肿等疾病 铜藻主要分布于我国辽宁半岛、山东半岛、浙江、福建和广东沿岸等 近年来水温升高且海洋富营养化导致铜藻的产量增加 铜藻富含多糖、多酚、岩藻黄质、植物甾醇及蛋白质等多种生物活性物质具有良好的经济利用价值铜藻岩藻多糖()是铜藻中主要的活性成分其具有抗氧化、抗病毒、降血糖、抗凝血和降尿酸等多种药理作用在医药、保健食品、食品及饲料等领域应用广泛 目前关于多糖的提取研究主要集中于传统的热水浸提但提取效率较低因此寻找合适的提取工艺具有重要意义匀浆提取法是加入溶剂利用匀浆机将组织进行粉碎或磨浆使目标成分加快溶出的一种方法该方法提取速度快、效率高且能耗低 本实验以铜藻为原材料采用匀浆法提取铜藻岩藻多糖在单因素试验基础上结合响应面优化试验()优化岩藻多糖提取工艺并对其抗氧化活性进行研究为铜藻岩藻多糖的工业化生产以及开发利用提供理论依据 仪器与材料.仪器 电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)电子天平赛多利斯科学仪器(北京)有限公司 粉碎机(温岭市林大机械有限公司)电热恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)纯水系统(精艺兴业科技有限公司)离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)全波长酶标仪(赛默飞世尔科技公司).材料铜藻由福建远扬藻业有限公司提供将铜藻洗净除去泥沙和杂质沥干水分烘干粉碎过 目筛备用岩藻糖(批号:自然资源部第三海洋研究所)苯酚生工生物工程(上海)股份有限公司四硼酸钠(索莱宝科技有限公司)二苯基三硝基苯肼()、联氮二(乙基苯并噻唑磺酸)二铵盐()、过硫酸钾上海麦克林生化科技有限公司浓硫酸、浓盐酸、咔唑、抗坏血酸()、二水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢(国药集团化学试剂有限公司)方法.铜藻岩藻多糖匀浆提取工艺优化.铜藻岩藻多糖的提取取.铜藻粉末加入适量的水固定匀浆转速水浴提取一段时间后冷却 离心 弃沉淀上清液过滤将过滤液定容至相同体积 采用苯酚硫酸法测定岩藻多糖含量.标准曲线绘制及多糖含量测定标准曲线绘制:精密称取 岩藻糖标准品.于 容量瓶中加水溶解并稀释至刻度配成 岩藻糖标准品溶液 分别吸取、.、.、.、.、.岩藻糖标准品溶液于 离心管中加水补足至.依次加入 苯酚.和.浓硫酸涡旋混匀后 水浴静置 于 处测定吸光度以 岩藻糖的浓度()为横坐标吸光度()为纵坐标绘制标准曲线得线性方程样品溶液的制备:将定容后的上清液取 置于离心管中加水补足至.加入 苯酚.和.浓硫酸涡旋混匀后 水浴静置 于 处测定吸光度根据公式()计算岩藻多糖提取率多糖提取率()():岩藻糖含量测定标准曲线对应的回归方程计算所得的浓度值:上清液定容的体积:稀释倍数:铜藻粉末质量.单因素试验 每次只变动一个条件其他条件不变考察因素提取时间(、)、液料比(、)、提取温度(、)、提取次数(、)对岩藻多糖提取率的影响.响应面优化设计在单因素试验结果的基础上根据响应面 试验设计原理设定提取时间()、提取温度()和液料比()这 个因素以岩藻多糖的提取率为考察指标对匀浆提取铜药学研究 .藻岩藻多糖的工艺参数进行优化.铜藻岩藻多糖样品的制备采用优化的最佳工艺提取铜藻岩藻多糖加入无水乙醇使提取液乙醇浓度达到 静置 离心 弃沉淀除去褐藻胶再继续加入无水乙醇使浓度达到 静置 离心 收集沉淀用无水乙醇洗涤沉淀 次真空干燥得岩藻多糖().铜藻岩藻多糖主要成分分析.多糖含量检测 精密称取.岩藻多糖配制成.的多糖溶液取.置于离心管中加入 苯酚.和.浓硫酸涡旋混匀后 水浴反应 于 处测定吸光度根据“.”项下方法得到的线性方程计算岩藻多糖的含量.糖醛酸含量检测采用咔唑硫酸法对多糖中糖醛酸含量进行测定 以半乳糖醛酸为标准品分别取.、.、.、.、.的半乳糖醛酸标准溶液用水补足至.冰水浴 分别加入.四硼酸钠浓硫酸溶液涡旋混匀沸水浴 取出后置于冰水浴中冷却再分别加入.咔唑无水乙醇溶液涡旋混匀沸水浴 冰浴冷却于 处测定吸光度值以半乳糖醛酸标准溶液浓度为横坐标 吸光度 为纵坐标绘制标准曲线 取样品溶液.代替标准液测吸光度值根据标准曲线可计算样品中糖醛酸含量.岩藻糖含量检测准确称取岩藻多糖样品 于 试管中加入.水再加入.浓盐酸置于沸水浴中水解 冷却至室温后用水定容至 采用离子色谱检测.铜藻岩藻多糖体外抗氧化活性研究.自由基清除活性参考李德龙等方法取不同质量浓度的铜藻岩藻多糖溶液 加 .乙醇溶液样品对照用无水乙醇代替 乙醇溶液空白对照用同体积超纯水代替多糖样品以 作阳性对照混匀后避光反应 于 处测吸光度清除率按照公式()计算清除率()():空白对照吸光度:反应后溶液的吸光度:样品对照的吸光度.自由基清除活性取相同体积的 溶剂(.)和过硫酸钾溶液(.)混匀置于暗处避光 备用 于 处将工作液的吸光值用磷酸盐缓冲液 稀释调整为.分别吸取 不同浓度多糖溶液与 工作液混匀室温避光静置 测定 处的吸光值清除率按照公式()计算清除率()():用超纯水代替多糖溶液的吸光度:反应后溶液的吸光度:样品对照的吸光度.羟自由基清除活性参考于靓等的方法分别取 不同浓度的多糖溶液加入.硫酸亚铁、.水杨酸乙醇溶液和.过氧化氢溶液各 加水定容至 混合均匀 水浴 冷却至室温后在 测定吸光度样品对照组用蒸馏水代替过氧化氢溶液空白组用蒸馏水代替样品以 作阳性对照清除率按照公式()计算清除率()():空白组用超纯水代替多糖溶液的吸光度:反应后溶液的吸光度:样品对照用超纯水代替过氧化氢溶液的吸光度 结果与分析.单因素试验.提取时间对铜藻岩藻多糖的影响在水浴温度为 液料比 提取次数为 次条件下研究提取时间、对岩藻多糖提取率的影响 结果显示随着匀浆时间的延长岩藻多糖提取率逐渐增加在 时达最高随后开始下降其原因可能是匀浆时间过长其他成分也一并溶出导致岩藻多糖提取率降低 因此选择 为最佳匀浆时间.提取温度对铜藻岩藻多糖的影响在提取时间为 液料比 提取次数为 次条件下研究提取温度、对岩藻多糖提取率的影响 结果显示随着提取温度的升高岩藻多糖提取率逐渐增加在 时达最高随后开始下降其原因可能是过高的热效应会造成部分多糖分解导致岩藻多糖提取率降低 因此选择 为最佳提取温度.液料比对铜藻岩藻多糖的影响在提取时药学研究 .间为 提取温度为 提取次数为 次条件下研究液料比、对岩藻多糖提取率的影响 结果显示随着液料比的增加岩藻多糖提取率逐渐增加在 时达最高当溶剂用量继续增加时提取率反而下降其原因可能是其他物质溶出抑制了多糖的溶出导致岩藻多糖提取率降低 因此选择 为最佳液料比.提取次数对铜藻岩藻多糖的影响在提取时间为 提取温度为 液料比 条件下研究提取次数、次对岩藻多糖提取率的影响 结果显示随着匀浆提取次数增多多糖溶出量越多但提取次数不断增加不利于后续的浓缩分离增加生产成本 因此确定匀浆提取次数为 次.响应面优化试验.岩藻多糖提取因素水平根据上述单因素试验结果选取提取时间()、提取温度()、液料比()个因素以岩藻多糖提取率作为响应值指标在 软件中设计 因素 水平响应面优化试验如表 所示表 响应面试验因素水平表因素水平 提取时间/提取温度/液料比/.响应面试验结果 每个因素各 个水平共 个试验点按照得到的试验条件对铜藻进行提取并利用软件 对数据进行回归分析结果如表 所示表 响应面试验方案及结果试验号多糖提取率().采用多元线性回归拟合铜藻岩藻多糖提取的响应值得到了提取时间()、提取温度()、液料比()和多糖提取率的二次多项式回归方程为:.显著性系数和结果方差分析的结果如表 所示可以看出模型.说明模型有较好的拟合度实际值与预测值相差不大具有较高的可信度相关系数.进一步表明试验值与模型预测值拟合度高 根据 值可得这 个因素中各因素对岩藻多糖提取率的影响为:提取温度()提取时间()液料比()说明提取时间和提取温度对多糖的提取影响极显著液料比对其提取率的影响相对较小 因素 和因素 的交互作用对结果影响最大表 响应面结果方差分析表变异来源平方和自由度均方 值 值显著性模型.提取时间.提取温度.液料比.残差.失拟项.纯误差.总和.注:表示差异极显著(.)表示差异显著(其中 交互项的影响显著 由图 可知提取温度的陡峭程度比提取时间的陡峭程度大说明提取温度对岩藻多糖提取率的影响大于提取时间 图 中提取时间和液料比陡峭程度相差不多说明两者对岩藻多糖提取率的影响区别不是很大 图 中提取温度比液料比的陡峭程度大说明提取温度对岩藻多糖提取率的影响大于液料比药学研究 .图 提取时间与提取温度相互作用对岩藻多糖提取率影响的响应面图和等高线图图 提取时间与液料比相互作用对岩藻多糖提取率影响的响应面图和等高线图图 提取温度与液料比相互作用对岩藻多糖提取率影响的响应面图和等高线图.最佳工艺的预测和验证通过软件 预测得到最佳工艺为:提取时间为.提取温度.液料比为.该条件下模型预测的最高多糖提取率为.考虑到实验条件将提取工艺参数调整为提取时间为 提取温度 液料比为 提取次数 次该条件下对铜藻进行提取实际测得岩藻多糖的平均提取为.液料比()得到多糖的最佳提取条件为:为提取时间为 提取温度 液料比为 提取次数 次岩藻多糖的提取率为.该工艺可以提高铜藻多糖的提取率代谢过程中会产生各种氧自由基和基等活性氧会对细胞和组织造成损伤导致衰老或者疾病的发生清除自由基可以预防氧化的加剧有研究表明岩藻多糖有着良好的抗氧化活性为天然抗氧化剂 等从马尾藻中分离纯化出一种新型的多糖 具有较强清除自由基的作用 本文研究铜藻岩藻多糖对、的清除率实验结果表明在多糖浓度达到.时岩藻多糖对、自由基的清除率与 接近说明其具有良好抗氧化活性为铜藻岩藻多糖进一步研究和应用提供参考依据参考文献:.().():.江苏省植物研究所.新华本草纲要.上海:上海科学技术出版社.孙建璋陈万东庄定根等.中国南麂列岛铜藻 实地生态学的初步研究.南方水产():.黄冰心丁兰平秦松等.铜藻的分类地位、生物地理分布以及 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