人WASH468和WASH465蛋白质特性辨析.pdf
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1、医学分子生物学杂志,2024,21(2):093-099 J Med Mol Biol,2024,21(2):093-099DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.02.001论 著资助项目:黑龙江省自然科学基金优秀青年项目(No.YQ2022C036),国家自然科学基金青年项目(No.31800648),黑龙江省教育厅优秀创新团队项目(No.2020-KYYWF-0001),齐齐哈尔医学院研究生创新基金项目(No.QYYCX2022-06)通讯作者:王涛(E-mail:wangtao )This work was supported by grants from
2、the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province(No.YQ2022C036),the National Natural ScienceFoundation of China(No.31800648),Education Department Foundation of Heilongjiang Province(No.2020-KYYWF-0001),the Graduate InnovationFoundation of Qiqihar Medical University(No.QYYCX2022-06)Correspondi
3、ng author:WANG Tao(E-mail:wangtao )人 WASH468 和 WASH465 蛋白质特性辨析郑皑雪1,2,张鲁平1,2,汤拓1,2,李萍1,2,洪鲜1,邓志会1,王涛11齐齐哈尔医学院医药科学研究院,蛋白质结构与功能研究室 黑龙江省齐齐哈尔市,1610002齐齐哈尔医学院医学技术学院 黑龙江省齐齐哈尔市,161000【摘要】目的 探讨两种较为公认但序列不同的 Wiskott-Aldrich 综合征蛋白和富含脯氨酸同源物(Wis-kott-Aldrich syndrome protein and SCAR homolog,WASH)的差异。方法 使用免疫荧光、免疫
4、共沉淀和激光微辐射等实验分析两种 WASH 在定位模式、与 FAM21 或 Ku 蛋白的相互作用、向 DNA 损伤位点募集速率和蛋白质稳定性方面的差异;比较多种生物中的 WASH 蛋白质序列和检测多种在生物和医学研究中常用的细胞中的 WASH 编码序列,分析两种人 WASH 序列的普遍性和保守性。结果 两种 WASH 展现出类似的内体(endosome)定位模式。WASH468 表现出与 FAM21 更强的相互作用,并且 WASH468 展现出更强的稳定性。WASH465 表现出与 Ku 蛋白更强的相互作用,并且 WASH465 展现出向 DNA 损伤位点更强的募集。多种生物中的 WASH 序
5、列与人 WASH468 序列的一致性明显高于 WASH465,并且多种在生物和医学研究中常用的细胞中的 WASH 氨基酸序列均与 WASH468 一致。结论WASH468 和 WASH465 的生物学特性存在差异,WASH468 序列的普遍性和保守性明显高于 WASH465,因此 WASH468 是更保守的人 WASH 序列。【关键词】Wiskott-Aldrich 综合征蛋白和富含脯氨酸同源物;蛋白序列;保守性;相互作用;DNA 修复【中图分类号】Q71,R34Comparison of Protein Characteristics of Human WASH468 andWASH465Z
6、HENG Aixue1,2,ZHANG Luping1,2,TANG Tuo1,2,LI Ping1,2,HONG Xian1,DENG Zhihui1,WANG Tao11Laboratory of Protein Structure and Function,Research Institute of Medicine and Pharmacy,Qiqi-har Medical University,Qiqihar,Heilongjiang,161000,China2College of Medical Technology,Qiqihar Medical University,Qiqih
7、ar,Heilongjiang,161000,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the differences between two well recognized Wiskott-Aldrich syndrome protein and SCAR homolog(WASH)with different sequences.MethodsIm-munofluorescence,immunoprecipitation,and laser micro-irradiation were used to analyze the differ-ences b
8、etween WASH468 and WASH465 in localization patterns,the interaction with FAM21 or Kuproteins,the recruitment to DNA damage sites and the protein stabilities.To analyze the universalityand conservation of the two types of WASH sequences,the WASH protein sequences in various or-ganisms were compared,a
9、nd the WASH coding sequences in various cell types commonly used forbiological and medical research were detected.Results Both WASH exhibited a similar way in lo-calizing to endosome.WASH468 exhibited a stronger interaction with FAM21,and was more stablethan WASH465.WASH465 exhibited a stronger inte
10、raction with Ku protein,and the recruitment ofWASH465 to DNA damage sites was more robust than that of WASH468.The degree of similarity ob-served between the sequence of WASH468 in humans and the sequences of WASH in other organ-isms was significantly greater than that observed with WASH465.Moreover
11、,the coding sequences ofWASH in various cell types,which are commonly utilized in biological and medical research,ex-hibited concordance with the sequence of WASH468.Conclusion There are differences in the bio-logical characteristics between WASH468 and WASH465,and WASH468 is significantly more uni-
12、versal and conserved than WASH465.Therefore,WASH468 is the conserved human WASH se-quence.【Key words】Wiskott-Aldrich syndrome protein and SCAR homolog;protein sequence;conser-vation;interaction;DNA repair 作为 Wiskott-Aldrich syndrome proteins(WASP)家族的成员之一,Wiskott-Aldrich Syndrome Proteinand SCAR Homo
13、log(WASH)是内体(endosome)上主要的促肌动蛋白成核因子(nucleation promoting fac-tors,NPFs)1-2。WASH 通过促进内体周围肌动蛋白微丝网络的形成,为内体中货运蛋白的分选和转运提供了支持。WASH 在哺乳动物的多种组织中广泛表达2,并且在多种真核生物中相对保守3-4。WASH通常存在于一个包含5 个成员的蛋白质复合物中,该复合物包括以下蛋白质:WASH、FAM21、Strumpel-lin、Strumpellin 与 WASH 相互作用蛋白(strumpellinand WASH-interacting protein,SWIP)、以及螺旋卷
14、曲结构域蛋白53(coiled-coil domain-containing protein53,CCDC53)5。其中 FAM21 与 WASH 存在着明确的直接相互作用,并且介导了 WASH 向内体的定位6。WASH 已被发现在内体介导的蛋白质分选、自噬、吞噬体成熟、肿瘤的发生发展和 DNA 双链断裂(double strand break,DSB)位点的再定位等细胞生物学过程中发挥作用1,7-16。在前期研究中,我们已报道了 WASH 可以通过与 Ku 蛋白的相互作用被募集至 DNA 损伤位点17。我们发现 WASH 的缺失会抑制 DNA 依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-dependen
15、t proteinkinasecatalyticsubunit,DNA-PKcs)的激活,迟滞了 DNA 损伤后组蛋白 H2AX和 KRAB 结构域相关蛋白 1(KRAB domain associ-ated protein 1,KAP1)的磷酸化,抑制了染色质的凝集状态解除和下游非同源末端连接(non-homol-ogous end joining,NHEJ)因子的募集,从而降低了 NHEJ 的效率17。在此基础上,我们近期报道了 FAM21 可以通过与 Ku 蛋白的相互作用聚集至DNA 损伤位点,并促进 WASH 向损伤位点的募集,从而促进 DNA 的修复18。我们也发现 WASH 的缺失
16、会促进外显子跳跃和加剧在复制压力下基因组的不稳定19-20。虽然目前对 WASH 的功能已经有了一定的了解,但关于野生型的人 WASH 氨基酸序列这个基本问题始终存在争议。当前存在两种较为公认的WASH 蛋白序列,两种 WASH 氨基酸长度分别 468AA(WASH468)和 465 AA(WASH465),两者之间一共存在 19 个氨基酸的差别。WASH 初始即是作为一个 468 AA 的蛋白质被鉴定,随后在包括本课题组在内的多个课题组也克隆使用着相同的 468AA 的 WASH1,6-7,17,20-23。但美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechn
17、ology Informa-tion,NCBI)和 UniProt 等公用数据库中的 WASH序列均为 WASH465(NCBI Gene ID:100287171,CCDS ID:78375.1,UniProt accession:A8K0Z3),并 且 Craig Blackstone 研 究 团 队 克 隆 使 用 了WASH465 在其 WASH 相关的研究中24-25。不同序列 WASH 的使用妨碍了 WASH 相关研究结论的重复性和可信度,也对新步入此领域的研究人员造成困扰。为分析两种 WASH 的异同,我们进行了进一步的 研 究 并 发 现 外 源 表 达 的 WASH468 和
18、WASH465 虽然展现出类似的内体定位模式,但WASH468 表现出与 FAM21 更强的相互作用,相对应地 WASH465 表现出与 Ku 蛋白更强的相互作用和向 DNA 损伤位点更强的募集,提示 WASH468和 WASH465 的生物学特性存在差异。更值得关注的是,多种生物中的 WASH 序列与人 WASH468 序列的一致性明显高于 WASH465,并且多种在生物学和医学研究中常用的细胞中的 WASH 序列均与WASH468 一 致。基 于 以 上 数 据,我 们 建 议WASH468 是更保守的人 WASH 序列。1 材料与方法1.1 材料人胚胎肾 293 细胞、人宫颈癌 HeLa
19、 细胞、人骨肉瘤 U2OS 细胞、人骨肉瘤 MG-63 细胞、人胰腺49郑皑雪,等.人 WASH468 和 WASH465 蛋白质特性辨析腺癌 BxPc-3 细胞、人胰腺癌 PANC-1 细胞、人食管癌 Eca-109 细胞和人大细胞肺癌 H460 细胞购自国家实验细胞资源共享服务平台。所有细胞均培养于含 10%FBS 的高糖 DMEM 培养基并置于 37 和 5%CO2的培养箱中。EEA1 抗体(610457)购自于 BD Biosciences。FAM21 抗体获赠于美国梅奥诊所 Daniel D.Billadeau 教授。Ku70 抗体(10723-1-AP)购 自 于Proteinte
20、chGroup。HA抗 体(ab9110)购自于 Abcam。Alexa FluorTM68 标记的羊抗 鼠 二 抗(A11004)购 自 于 Thermo Fisher。Mouse Monoclonal anti-rabbit IgG-HRP(sc-2357)购自 Santa Cruz Biotechnology。1.2 质粒构建pCMS3.H1p.shWASH/HA-YFP 和 pCMS3.H1p.shWASH/HA-YFP-WASH468 获赠于美国梅奥诊所 Daniel D.Billadeau 教 授。pCMS3.H1p.sh-WASH/HA-YFP-NLS.WASH468 质粒的构建
21、我们已在之 前 的 文 章 中 报 道17。NLS.WASH465 序 列DNA 委托上海生工生物工程公司合成并插入至 pC-MS3.H1p.shWASH/HA-YFP 质 粒。WASH465 的DNA 片段以 pCMS3.H1p.shWASH/HA-YFP-NLS.WASH465 质粒为模板,以引物 5-ACTGGAATTCAT-GACTCCTGTGAGGATGCAGC 和 5-ATAAGAATGC-GGCCGCCTACGATTCCCAGTCGTCCTCG 扩增获得,并插 入 至 pCMS3.H1p.shWASH/HA-YFP 质 粒 的EcoR和 Not酶切位点,从而获得 pCMS3.H1
22、p.shWASH/HA-YFP-WASH465 质粒。1.3 免疫荧光使用 X-tremeGENE HP(MERCK Roche,XT-GHP-RO)转 染 试 剂 分 别 转 染 pCMS3.H1p.sh-WASH/HA-YFP-WASH468和pCMS3.H1p.sh-WASH/HA-YFP-WASH465 至 HeLa 细胞。48 h 后,使用 4%多聚甲醛固定细胞 10 min,0.15%TritonX-100 通透细胞 5 min,封闭液(5%羊血清、1%甘油、0.1%BSA、0.1%鱼皮胶和 0.04%叠氮化钠溶于 PBS 中)封闭细胞 30 min 后,加入 EEA1 抗体于4
23、过夜孵育。PBS 洗 5 遍后,Alexa FluorTM568 标记的羊抗鼠二抗室温孵育 1 h,PBS 洗 5 遍后,Ho-echst33342 染核 3 min,用 PBS 洗两遍。使用 ZeissLSM-710 激光共聚焦显微镜在 63 倍油镜下拍照样品,并使用 ImageJ 软件处理分析图片。1.4 蛋白 3 D 结构预测使用蛋白结构在线预测工具 Phyre2(网址 ht-tp:/www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index),输入 WASH468 和 WASH465 的氨基酸序列,选择 Intensive Modelling
24、Mode 对 WASH465 和WASH468 的结构进行预测。1.5 免疫沉淀使用 PEI 转染试剂转染质粒 pCMS3.H1p.HA-YFP、pCMS3.H1p.shWASH/HA-YFP-WASH468 和pCMS3.H1p.shWASH/HA-YFP-WASH465 至 293 细胞。48 h 后使用裂解液(20 mmol/L Hepes pH7.2,50 mmol/L 醋酸钾,200 mmol/L D-sorbitol,1 mmol/LEDTA,0.1%Triton X-100,0.5 mmol/L PMSF,2mmol/L Na3VO4和蛋白酶抑制剂)在冰上裂解细胞30 min,4
25、 离心 10 min 后收集上清。调整各组细胞裂解液至相同浓度后加入 EZviewTMRed anti-HAaffinity beads(sigma E6779)各20 L,4 旋转过夜。使用裂解液洗 5 次后,使用含 SDS 的 1 LoadingBuffer 在 95 将蛋白洗脱,离心收集上清,进行蛋白质印迹实验(Western blotting)。1.6 激光微辐射(laser micro-irradiation)使用 PEI 转染试剂转染 pCMS3.H1p.shWASH/HA-YFP-NLS.WASH468 和 pCMS3.H1p.shWASH/HA-YFP-NLS.WASH465
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