寄生于金鱼肌肉和肝胰脏的吴李碘泡虫形态特征与分子鉴定.pdf
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1、 渔业研究,():收稿日期:基金项目:综合保障项目(北京市水产技术推广站业务运转)作者简介:王小亮(),男,高级工程师,主要从事水产动物病害防治。:通信作者:徐立蒲(),男,研究员,从事水产动物病害防治。:王小亮,曹 欢,王 姝,等 寄生于金鱼肌肉和肝胰脏的吴李碘泡虫形态特征与分子鉴定 渔业研究,():寄生于金鱼肌肉和肝胰脏的吴李碘泡虫形态特征与分子鉴定王小亮,曹 欢,王 姝,吕晓楠,王静波,张 文,王 澎,徐立蒲(北京市水产技术推广站,北京)摘要:年 月,北京市通州区相邻两家观赏鱼养殖场的金鱼()发生孢子虫病,患病鱼头背部肌肉隆起或腹部膨大而失去观赏价值,并造成少量死亡。为鉴定金鱼源孢子虫的
2、种类,采集具有临床症状的病鱼,取病灶组织制作水封片进行孢子虫形态观察和形状测量,并进一步对孢子虫的 进行克隆、测序和生物信息学分析。结果表明:造成金鱼头背部肌肉隆起或肝胰脏膨大的孢子虫壳面观均呈梨形,前端有 个八字形排列的极囊,极囊约占孢子虫全长的一半,极丝圈数为 圈,形态特征和形状测量数据与吴李碘泡虫()相似。孢子虫的 序列经 同源性检索,与吴李碘泡虫同源性最高,相似性在 以上,构建的系统发育树也与吴李碘泡虫聚为一枝。因此,确认这两起金鱼孢子虫病的病原为吴李碘泡虫,这是该碘泡虫寄生于金鱼肌肉的首次报道,为其在金鱼寄生部位的研究提供了资料。关键词:金鱼;吴李碘泡虫;形态特征;分子鉴定中图分类号
3、:文献标识码:文章编号:()金 鱼()隶 属 于 鲤 形 目()、鲤科()、鲫属(),是中国传统的观赏鱼养殖种类,在中国除西藏外的所有省市都有养殖生产,年产值近 亿元,同时也是世界流行的观赏鱼品种之一。在金鱼养殖过程中,寄生虫病是发病率较高的一类病害,感染金鱼的寄生虫有黏孢子虫类 如碘泡虫()、单极虫()等、斜 管 虫()、车 轮 虫(、)、小瓜虫()、指环虫()、三代虫()、双 穴 吸 虫()、锚头鳋()、()等。碘泡虫是黏孢子虫中最大的类群,全世界已报道的有 余种,中国记录的有 多种,其中寄生于鲫()的碘泡虫最多,有 余种。碘泡虫可寄生于鱼类和两栖类的各类组织中,有些种具有宿主或组织特异性
4、,在寄主组织大量寄生时可引起严重的疾病。以往对碘泡虫的研究主要围绕其在经济鱼类的危害,分析碘泡虫的寄生部位,描述造成的症状,并通过形态学特征对其进行分类研究。随着分子生物学技术的应用,分子鉴定方法为碘泡虫的分类鉴定提供了重要补充,并为碘泡虫的中间宿主生活阶段研究和新种的发现提供了便捷方法。已报道的感 染 金 鱼 的 碘 泡 虫 种 类 有 异 样 碘 泡 虫()、洪湖碘泡虫()、晶壳缝碘泡虫()、卡特碘泡虫()、红河碘泡虫()、吴李碘泡虫()和关桥碘泡虫(渔业研究第 卷)等。年 月,在北京市通州区相邻的两家观赏鱼养殖场发生孢子虫病,感染部位分别为肝胰脏和肌肉。为鉴定病原种类,通过采集样品,利用
5、形态学特征和 等方法进行鉴定,明确金鱼所感染的孢子虫种类,旨在丰富金鱼孢子虫病的资料。材料方法 实验金鱼 年 月,取北京市通州区两家相邻观赏鱼养殖场的发病金鱼样品,其中一家金鱼品种名称为鎏金,病鱼头背部呈瘤状隆起,样品编号为;另一家金鱼品种名称为草金鱼,腹部膨大,样品编号为。病鱼体长均约 、体质量约 ,采样时水温约、溶解氧浓度为 、为 。方法 样品采集和保存样品(和)金鱼解剖后,肉眼观察各组织白色包囊存在的情况,然后制作鳃丝、肌肉瘤状隆起组织、肝胰脏、肾、脾、性腺等组织的水封片进行孢子虫镜检。观察到孢子虫的样品组织,样品取肌肉 瘤 状 隆 起 流 出 液 及 周 边 肌 肉 组 织;样品取肝胰
6、脏组织,匀浆后添加 乙醇进行固定,固定后的样品组织均于 保存。孢子虫形态学观察和形状测量取 乙醇固定的样品(和),制作水封片,置于 显微镜下观察孢子虫形态,采用 图像软件拍照,测量孢子虫长(,)、孢子虫宽(,)、孢子虫厚度(,)、极囊长(,)、极 囊 宽(,),以及确定极丝圈数(,),每个样品测量 个虫体。孢子虫 的克隆与测序)提取分别取 乙醇固定的样品(和),用 超纯水充分冲洗,再以 离心 ,舍弃上清液,重复 次。采用 (,德国)试剂盒,按照说明书抽提基因组,并置于 保存备用。)扩增用于扩增 的引物参考 等设计的碘泡虫属的通用引物:、:进 行 扩增。反应体系组成:、上下游引物各 、模板 、。
7、反应条件:;、,个循环;,保存。扩增产物经纯化后,送至上海生工生物工程技术公司进行基因序列测定。系统发育树的构建与分析将测序样品(和)的 基因序列提交至 数据库,获得基因登录号。同时,将两条序列通过 的 检索系统进行序列同源性分析,从中选取与所获序列同源性较高的同种虫的 基因序列,并从 数据库中获得相关属的 序列,利用 、邻位连接法(,)构建系统发育树。通过自举分析进行置信度检测,自举数集 次。以武汉单极虫的 序列为外源序列。数据处理样品(和)的孢子虫长、宽和极囊长、宽的测量数据以平均值 标准差表示。采用单因素方差分析两样品之间及大、小极囊之间的差异,以 为显著。结果与分析 病鱼临床症状发病金
8、鱼均出现不摄食、打蔫、离群独游等行为特征。发病的鎏金()头背部两侧有一对瘤状大囊泡(图),剪开后流出白色黏稠液,肌肉组织糜烂成糊状,制备的组织水浸片镜下可见包囊和大量的孢子虫(图);肝胰脏部分呈白色,取该组织制作水浸片,在显微镜下可见包囊和大量孢子虫;其他组织未见包囊和孢子虫。发病的草金鱼()腹 第 期王小亮等:寄寄生生于于金金鱼鱼肌肌肉肉和和肝肝胰胰脏脏的的吴吴李李碘碘泡泡虫虫形形态态特特征征与与分分子子鉴鉴定定部膨大,解剖后见肝胰脏呈灰白色、体积严重增大(图),制备的组织水浸片镜下可见有包囊和大量孢子虫(图),鳃和其他内脏组织未见包囊和孢子虫。图2BTXD210907肌肉隆起组织流出液水浸
9、片(400)Fig.2The dorsolateral humps tissue outflow ofBTXD210907 smear showing cyst and numerousspores(400)图3BTXL210907金鱼肝胰脏组织水浸片(400)Fig.3The hepatopancreas tissue of goldfishBTXL210907 smear showing cyst and numerousspores(400)AB图1感染孢子虫的金鱼背部隆起(A)、肝胰脏膨大(B)Fig.1Showing dorsolateral humps(A)and enlarged
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