基于TLR4_NF-κB通路探究NLRP3对铜绿假单胞菌的清除机制.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(1):032-038 J Med Mol Biol,2024,21(1):032-038DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.01.005资助项目:山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(No.BS2020SW1099)通讯作者:刘鑫(电话:[phone],E-mail:)This work was supported by a grant from the Shandong Province Outstanding Young andMiddle-agedScientists ResearchAward Fund(No.BS2020SW1099)Corresponding author:LIU Xin(Tel:[phone],E-mail:)基于 TLR4/NF-B 通路探究 NLRP3 对铜绿假单胞菌的清除机制刘鑫,李茂新,闫丙健,续宗杰山东第一医科大学附属人民医院烧伤整形科 济南市,271199【摘要】目的 基于 TLR4/NF-B 通路探究 NLRP3 对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)的清除机制。方法 采用 PA 感染的 HP-1 诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞,然后沉默巨噬细胞中 NLRP3(si-NLRP3)和 TLR4(si-TLR4),用 ELISA 检测上清液中 IL-1 和 IL-8 的表达水平;RT-PCR 检测细胞中 NLRP3、caspase-1 mRNA 表达;蛋白质印迹检测细胞中 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达。结果 铜绿假单胞菌感染的 THP-1 诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞 hMDMs 上清液中 IL-1、IL-8 水平、NLRP3、caspase-1 mRNA 表达及 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达明显增加(P0.05)。和 si-NC 组相比,THP-1 诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞 hMDMs 沉默 NLRP3 和 TLR4 后的 si-NLRP3 和 si-TLR4 组上清液中 IL-1、IL-8 表达、NLRP3、caspase-1 mRNA 表达及 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达水平明显降低(P0.05)。和 si-NC 组相比,沉默 PA 感染的 THP-1 巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞 hMDMs中 NLRP3 和 TLR4 表达细胞清除率明显增加(P0.05)。结论 沉默 NLRP3 可增加巨噬细胞对 PA 的清除作用,其作用机制可能和抑制 TLR4/NF-B 信号通路激活有关。【关键词】TLR4/NF-B 通路;NLRP3;铜绿假单胞菌;巨噬细胞【中图分类号】R378.84Clearance Mechanism of NLRP3 Against Pseudomonas aeruginosa viaTLR4/NF-B PathwayLIU Xin,LI Maoxin,YAN Bingjian,XU ZongjieDepartment of Burn and Plastic Surgery,Affiliated Peoples Hospital of Shandong First Medical Uni-versity,Jinan,271199,China【Abstract】Objective To investigate the clearance mechanism of NLRP3 against Pseudomonasaeruginosa(PA)based on TLR4/NF-B pathway.Methods PA-infected HP-1-induced differenti-ated macrophages and primary human monocyte-derived macrophages were used for following experi-ments.NLRP3 and TLR4 were later silenced in macrophages by siRNAs(si-NLRP3 and si-TLR4),and the expression levels of IL-1 and IL-8 in the supernatant were detected by ELISA.The mRNAexpression levels of NLRP3 and caspase-1 were detected by RT-PCR.The protein expression levelsof TLR4 and p-NF-B P65 were detected by Western blotting.Results The levels of IL-1,IL-8,the mRNA expression levels of NLRP3,caspase-1 and TLR4,and the protein expression level of p-NF-B P65 were significantly increased in the supernatants or cells of the PA-infected THP-1-in-duced differentiated macrophages and primary human monocyte-derived macrophages hMDMs(P0.05).The levels of IL-1,IL-8,the expression levels of NLRP3,caspase-1 mRNA and TLR4,p-NF-B P65 protein in the supernatants of the si-NLRP3 and si-TLR4 groups(NLRP3 and TLR4were silenced in THP-1-induced differentiated macrophages and primary human monocyte-derivedmacrophages hMDMs)were significantly reduced when compared with those in the si-NC group(P0.05).The clearance rate was significantly increased in NLRP3 and/or TLR4 silenced PA-infec-ted THP-1 macrophages and primary human monocyte-derived macrophage hMDMs when comparedwith that in the si-NC group(P0.05).Conclusion Silencing NLRP3 increases the clearance ofPseudomonas aeruginosa by macrophages,and the mechanism may be related to the inhibition ofTLR4/NF-B signaling pathway activation.【Key words】TLR4/NF-B pathway;NLRP3;Pseudomonas aeruginosa;macrophages 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是烧伤科最常见的革兰阴性菌,大面积深度烧伤患者由于伤口开放、愈合及用药时间长,易导致该细菌的感染,该病菌也是引起医院获得性感染的主要致病菌之一,可在人机体的任何部位定植,进而导致不同程度的感染发生1-2。临床数据统计,目前肺炎患者因感染 PA 死亡的人数超过 40%,且感染同时伴随其它并发症的死亡率已超过 70%3。目前临床上常用抗菌药物治疗 PA4,虽能一定程度改善患者病情,但由于抗生素的滥用及 PA 天然的耐药性等问题,导致治疗效果并不理想。核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oli-gomerization domain-like receptors,NLR)是目前研究较广泛的模式识别受体之一,主要存在于胞浆中,可介导机体的天然免疫应答5。目前,NLR家族成员热蛋白结构域蛋白 3(NOD-like receptorpyrin domain containing3,NLRP3)炎症小体是目前研究最多的炎症小体之一,其能激活胱冬肽酶-1(caspase-1),进而对白细胞介素(IL)-1 家族细胞因子的加工及成熟发挥促进作用6。有研究发现,在胆囊纤维化患者的支气管上皮细胞和巨噬细胞中 PA 能够激活 NLRP3 炎症小体,但 PA 感染人巨噬细胞炎症小体的激活情况及炎症对 PA 感染的清除机制鲜有报道7。Toll 样受体(Toll-Like re-ceptors,TLRs)是型跨膜蛋白,是一类保守的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),可通过识别病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecular patterns,PAMPs)而激活下游的核因子B(nuclear factor B,NF-B)信号通路,调控多种炎症介质和细胞因子的表达,启动针对病原体的天然免疫和获得性免疫8。有研究发现9,TLR4在肺部感染发生时被激活,从而对肺内成纤维细胞中脂多糖诱导的促炎细胞因子的产生发挥促进作用,因此猜测 TLR4/NF-B 信号通路引发的过度炎症可能是导致 PA 感染死亡的重要原因。因此,本研究旨在探究 NLRP3 对 PA 的清除作用及 TLR4/NF-B 信号通路能否成为 NLRP3 影响 PA 清除的作用机制。1 材料与方法1.1 试剂与仪器铜绿假单胞菌(招远拓普生物工程有限公司);人单核细胞系 THP-1 细胞(ATCC 公司);佛波酯(PMA)(美国 Sigma 公司);淋巴细胞分离液(中国 TBD sciences 公司);CD14 磁珠(美国 BD 公司);人重组细胞因子 M-CSF(美国 Pep-rotech 公司);ELISA 试剂盒(美国 BD 公司);Tr-izol 试剂、TLR4 干扰 RNA(si-TLR4)、TLR4 激活剂 LPS(美国 Invivogen 公司);TLR4 抗体、p-NF-B P65 抗体(美国 Invivogen 公司);PCR 引物(上海生工合成);PCR 仪(Gene Inc 公司)。1.2 细胞培养取 THP-1 细胞,将 PMA 加入到 THP-1 细胞中诱导分化为巨噬细胞,16 h 后将巨噬细胞置于含10%胎牛血清和双抗的完全 DMEM 培养基中培养,将培养基置于恒温培养箱中培养,设置培养箱条件为 37、5%CO2。收集生长良好的巨噬细胞接种于 24 孔板中,用 PA 刺激巨噬细胞 24 h,随后收集细胞上清液,用于后续实验。1.3 人外周血巨噬细胞的分离培养在人外周抗凝血中加入等体积的培养基,充分混匀后,将淋巴细胞分离液按照 12 的比例加入到人抗凝外周血中,在 20 环境,以 1 800 r/min 的速度离心人抗凝外周血30 min,分离血细胞。将位于中间的单核细胞层收集于离心管中,加入 PBS溶液,在 4 环境,离心机 1 500 r/min 速度离心10 min,PBS 洗涤细胞 2 次后,收集细胞沉淀。将CD14 磁珠加入到细胞沉淀中,分选出的人单核细胞并培养,置于含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基上,并加入 100 ng/mL 的人重组细胞因子 M-CSF,根据细胞计数结果进行铺板,培养于37 环境中。第 3 天换液,7 d 后诱导呈巨噬细胞备用。用 PA刺激巨噬细胞24 h,随后收集细胞上清液,用于后续实验。1.4 细胞培养及感染菌液制备使用前,将 PA 接种于假单胞菌琼脂平板,在常规的培养箱中培养,设置温度恒定 37;使用时挑取单菌落,并接种于 LB 培养基中,将培养基置于恒温摇床上,37、200 r/min 的条件下培养12 h,梯度稀释菌液,直至菌液终浓度为 109CFU/mL 备用;使用时以 MOI=5 感染细胞,即感染时1 个细胞对应 5 个细菌。1.5 ELISA 检测细胞中 IL-1、IL-8 水平收集细胞培养上清液,按照 ELISA 试剂盒说33医学分子生物学杂志,2024,21(1):032-038 J Med Mol Biol,2024,21(1):032-038明书检测细胞上清液中 IL-1、IL-8 水平。1.6 RT-PCR 检测细胞中 NLRP3、caspase-1 mRNA 表达取 THP-1 巨噬细胞和 hMDMs,用 PA 刺激巨噬细胞 24 h,后用 Trizol 裂解细胞并提取细胞中总RNA,提取步骤按照试剂盒说明书进行。逆转录总RNA 为 cDNA,操作步骤按照试剂盒说明书操作。NLRP3 上游引物 5-CAGCGATGAAGACGCGAGAG-3,下游引物 5-AGAGATATGGCACGAAAGCTATC-CA-3;caspase-1 上游引物5-ACTGCTACACCTGTT-GCGCCTCA-3,下 游 引 物 5-CTGCCGACGCAGG-AAATTC-3;GAPDH 上 游 引 物 5-CAACTCCCTC-AAGATTGTCAGCAA-3,下游引物 GGCATGGACT-GTGGTCATGA。瞬时离心引物,加入去离子水,充分混匀并制成 100 mol/L 的贮存液;把上游、下游引物稀释成终浓度10 mol/L 的溶液。PCR 反应条件:95 预变性3 min;95 变性 10 s;60 退火30 s;共计40 个循环。用2-CT法分析表达量。1.7 蛋白质印迹检测细胞中 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达蛋白裂解液充分提取各组 THP-1 巨噬细胞和hMDMs 总蛋白,DAB 法检测细胞中蛋白浓度。配置等浓度蛋白溶液为 2 g/mL,按照 61 的比例加入相应的体积的蛋白负载缓冲液,煮沸溶液10 min后保存蛋白溶液于-20 的冰箱。取蛋白样品 30g,电泳蛋白样品后转移到 PVDF 膜上,加入5%的脱脂奶粉到 PVDF 膜上,封闭 PVDF 膜 1 h,分别加入一抗(11 000),在 4 环境中孵育一抗过夜,后清洗 PVDF 膜,加入相应的二抗(1 1000),室温孵育二抗 2 h。将 ECL 发光剂加入到细胞中曝光,用显影液显影,用 Image Lab 软件分析各条带灰度值。1.8 小 RNA 干扰实验及 PA 感染按照转染试剂 LipofectamineTM2000 说明书,分别将 si-NLRP3 及阴性对照 si-NC、si-TLR4 转染到THP-1 巨噬细胞和人单核细胞来源巨噬细胞(hM-DMs)中,分别设为 si-NC 组、si-NLRP3 组和 si-TLR4 组。将各组 THP-1 巨噬细胞和 hMDMs 加入到铜绿假单胞菌中共孵育 1 h,后进行后续实验。1.9 细菌平板计数实验取 THP-1 巨噬细胞和 hMDMs 加入 PA 共孵育1 h后,更换含 300 g/mL 庆大霉素的培养基培养30 min,以清除胞外菌;将孔板用 PBS 溶液清洗干净,后将 0.1%TritonX-100 加入到孔板中,将孔板置于冰上裂解10 min,待细胞充分裂解并释放出大量的细菌,梯度稀释细胞裂解液,在 PA 平板上将细胞均匀的涂布,每个稀释浓度设置 3 个平板;将平板置于 37 环境中过夜,次日对平板菌落计数。细胞清除率=CFU(1 h)-CFU(2 h)/CFU(1 h)100%。1.10 统计学分析实验数据采用 Graphpad priam 8.0 软件进行统计学分析。计量资料均用均数 标准差(x s)表示。不同组间数据采用单因素方差(one-way ANO-VA)分析,各组间两两比较采用 LSD-t 检验,实验结果以 P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 PA 感染巨噬细胞后 IL-1、IL-8 水平比较PA 感染的 THP-1 诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞 hMDMs 上清液中 IL-1、IL-8水平明显增加(P0.05)(图 1)。和 si-NC 组相比,THP-1 诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞 hMDMs 沉默 NLRP3 和 TLR4 后的 si-NL-RP3 和 si-TLR4 组上清液中 IL-1、IL-8 表达水平明显降低(P 0.05)(图 2)。A、B:THP-1 巨噬细胞在 PA 感染24 h 时细胞上清液中 IL-1、IL-8 表达水平;C、D:hMDMs 在 PA 感染24 h 时细胞上清液中 IL-1、IL-8 表达水平。P0.05。图 1 PA 感染巨噬细胞后 IL-1、IL-8 表达比较43刘鑫,等.基于 TLR4/NF-B 通路探究 NLRP3 对铜绿假单胞菌的清除机制A、B:THP-1 巨噬细胞沉默 NLRP3 和 TLR4 后上清液中 IL-1、IL-8 表达水平;C、D:hMDMs 沉默 NLRP3 和TLR4 后上清液中 IL-1、IL-8 表达水平。1:si-NC 组;2:si-NLRP3 组;3:si-TLR4 组。P0.05。图 2 巨噬细胞沉默 NLRP3 和 TLR4 后上清液中 IL-1、IL-8 表达比较2.2 PA 感染巨噬细胞后 NLRP3 和 caspase-1 mRNA 表达比较 PA 感染的 THP-1 诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞 hMDMs 中 NLRP3、caspase-1mRNA 表达明显升高(P0.05)(图 3)。与 si-NC 组比较,THP-1 诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞 hMDMs 沉默 NLRP3 和TLR4 后的 si-NLRP3 和 si-TLR4 组细胞中 NLRP3、caspase-1 mRNA 表达明显地降低(P 0.05)(图 4)。A、B:THP-1 巨噬细胞在 PA 感染 24 h 时 NLRP3、caspase-1 mRNA 表达比较;C、D:hMDMs 在 PA 感染 24 h 时NLRP3、caspase-1 mRNA 表达比较。P0.05。图 3 PA 感染巨噬细胞后 NLRP3 和 caspase-1 mRNA 表达比较A、B:THP-1 巨噬细胞沉默 NLRP3 和 TLR4 后细胞中 NLRP3 和 caspase-1 mRNA 表达比较;C、D:hMDMs 沉默 NLRP3和 TLR4 后细胞中 NLRP3 和 caspase-1 mRNA 表达比较。1:si-NC 组;2:si-NLRP3 组;3:si-TLR4 组。P0.05。图 4 巨噬细胞沉默 NLRP3 和 TLR4 后细胞中 NLRP3 和 caspase-1 mRNA 表达比较2.3 PA 感染巨噬细胞后 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达比较PA 感染的THP-1 诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞hMDMs 中TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达明显增加(P0.05)(图 5、图 6A)。和 si-NC 组相比,THP-1 诱导分化的巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞 hMDMs 沉默 NLRP3 和 TLR4 后的 si-NLRP3 和 si-TLR4 组细胞中 TLR4、p-NF-BP65 蛋白表达明显降低(P 0.05)(图6B、图7)。53医学分子生物学杂志,2024,21(1):032-038 J Med Mol Biol,2024,21(1):032-038A、B:THP-1 巨噬细胞在 PA 感染24 h 时细胞中 TLR4、p-NF-B P65 蛋白的表达;C、D:hMDMs 在 PA 感染24 h时细胞中 TLR4、p-NF-B P65 蛋白的表达。P0.05。图 5 PA 感染巨噬细胞后 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达比较A:THP-1 巨噬细胞感染 PA 24 h 时及沉默 NLRP3 和 TLR4 后细胞中 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达;B:hMDMs 感染 PA24 h 时及沉默 NLRP3 和 TLR4 后细胞中 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达。1:si-NC 组;2:si-NLRP3 组;3:si-TLR4 组。图 6 巨噬细胞中 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达A、B:THP-1 巨噬细胞沉默 NLRP3 和 TLR4 后细胞中 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达比较;C、D:hMDMs 沉默NLRP3 和 TLR4 后细胞中 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达比较。1:si-NC 组;2:si-NLRP3 组;3:si-TLR4 组。P0.05。图 7 巨噬细胞沉默 NLRP3 和 TLR4 后细胞中 TLR4、p-NF-B P65 蛋白表达比较2.4 细胞清除率比较和 si-NC 组相比,沉默 PA 感染的 THP-1 巨噬细胞和原代人单核来源巨噬细胞 hMDMs 中 NLRP3 和TLR4 表达细胞清除率明显增加(P0.05)(图8)。1:si-NC 组;2:si-NLRP3 组;3:si-TLR4 组。P 0.05图 8 沉默 NLRP3 和 TLR4 抑制铜绿假单胞菌的清除3 讨论PA 是烧伤科及院内感染的一种常见病原体,可通过感染不同部位引发多种严重症状的发生,包括肺炎、脑膜炎、心肌炎等10。由于 PA 的细胞膜通透性较差,导致多数的抗生素在菌体内不能发挥很好的疗效,因此临床上用抗生素治疗铜绿假单胞菌感染性疾病的效果并不理想11。目前关于 PA 导致炎症及感染发生的机制鲜有报道,因此,本研究旨在探究 PA 诱导巨噬细胞分泌炎症因子的具体机制,为临床研发新药物提供更多的实验依据,对临床治疗感染 PA 所致疾病尤为重要。NLRP3 作为固有免疫系统重要组成部分的炎症小体,其在髓样细胞中广泛表达,包括中性粒细63刘鑫,等.基于 TLR4/NF-B 通路探究 NLRP3 对铜绿假单胞菌的清除机制胞和单核巨噬细胞等,且能识别细胞、病毒等病原体及 LPS 等危险信号分子12。在巨噬细胞中,NL-RP3 炎症小体的表达是感染性疾病的典型特征13。研究发现,NLRP3 炎症小体可由环境刺激物、内源性危险信号以及致病菌如 PA 等激活,进而通过促进炎症小体的集合而分泌大量的炎症细胞因子14。本研究通过培养 THP-1 诱导分化的巨噬细胞及原代人单核来源巨噬细胞 hMDMs,并用 PA 感染 THP-1 和 hMDMs 发现,巨噬细胞中 NLRP 和caspase-1 的相对表达明显增加,且会分泌大量的IL-1 和 IL-8。有研究发现,IL-1 是目前研究最关键的免疫调节及促炎细胞因子,其不仅可被caspase-1 加工,还能被炎症小体所激活15。在单核细胞分化过程中,IL-1 可通过促进分化为 M1样巨噬细胞而促进 B 淋巴细胞的增殖和分化。由此可见,IL-1 可能参与 PA 的免疫应答过程,并且还能对炎症小体的激活发挥促进作用。有学者通过对感染铜绿假单胞菌的肺炎研究发现,机体内IL-1 和 IL-18 水平增加会减弱对 PA 的杀伤力16;还有学者研究发现,当小鼠 caspase-1 缺陷时,PA感染的小鼠眼部炎症和角膜荷菌量明显减少17。本研究通过进一步转染沉默 si-NLRP3 发现 THP-1和 hMDMs 细胞上清液中 IL-1 和 IL-8 水平降低,同时抑制细胞中 NLRP3 和 caspase-1 表达,增加对PA 的清除率。因此提示 NLRP3 炎症小体的激活有可能是 PA 逃避免疫杀伤的策略,但其具体的机制尚不清楚。在固有免疫应答中,TLRs 是重要的蛋白调控分子之一,激活 TLRs 可和特异性免疫及非特异性免疫应答相连接18。TLR4 是 TLRs 家族成员之一,其可对革兰阴性菌的脂多糖进行识别,进而通过激活不同的信号通路对促炎细胞因子的分泌发挥诱导作用。本研究结果显示,PA 感染巨噬细胞 THP-1和 hMDMs 后,细胞中 TLR4 的表达明显增加,猜测在 PA 激活炎症反应时 TLR4 是主要受体。当细胞膜上的 TLR4 和 PA 相结合时会激活 NF-B 信号传导通路,进而对细胞炎症因子的基因转录及蛋白表达发挥调节作用。Lee 等19研究发现,用 PA 感染肺上皮细胞后会激活 NF-B 信号通路,进而介导炎症的发生发展;还有学者研究发现20,不同浓度的 PA 刺激 U937 后可激活 NF-B 信号通路,进而对炎症因子 IL-8 的产生发挥促进作用。本研究结果显示,PA 感染巨噬细胞 THP-1 和 hMDMs后,NF-B 信号传导通路的 P65 蛋白被磷酸化,且蛋白表达明显增加,由此提示,在 PA 感染巨噬细胞时 TLR4 及其下游因子在引发炎症反应中发挥重要作用,可能是帮助 NLRP3 激活时 PA 逃避免疫杀伤策略的机制之一。本研究通过进一步转染沉默si-TLR4 时发现 THP-1 和 hMDMs 细胞上清液中 IL-1 和 IL-8 水 平 降 低,抑 制 细 胞 中 NLRP3 和caspase-1 表达及 TLR4 和 P65 表达,增加对 PA 的清除率,提示抑制 PA 感染巨噬细胞中 TLR4/NF-B 的激活,可能是增加巨噬细胞对 PA 杀伤的机制。综上所述,沉默 NLRP3 可增加巨噬细胞对铜绿假单胞菌的清除作用,其作用机制可能和抑制TLR4/NF-B 信号通路激活有关。由于时间和成本等因素,本研究尚未对活化的 TLR4/NF-B 信号通路能都影响巨噬细胞对 PA 杀伤作用进行研究,使研究结果存在一定局限性。在今后的研究中,会增加激活 TLR4/NF-B 信号通路及作用于其它下游分子的研究,为临床治疗感染 PA 所致的疾病提供更多的实验数据。参考文献1THI M T T,WIBOWO D,REHM B H 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