钩吻总碱诱导慢性粒细胞白血病K562细胞凋亡的机制分析.pdf
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1、实验研究 基金项目:国家中医药管理局临床中药学高水平中医药重点学科建设项目(.国中医药人教函 号)福建中医药大学校管课题财政专项(.)作者简介:王文义男硕士研究方向:临床中药学:.通信作者:李德森男硕士副教授研究方向:临床中药学:.钩吻总碱诱导慢性粒细胞白血病 细胞凋亡的机制分析王文义檀兴慧卢伊李德森吴水生(.福建中医药大学科技创新与转化中心福建 福州.福建中医药大学药学院福建 福州.都昌县中医院江西 九江)摘要:目的 探讨钩吻总碱对慢性粒细胞白血病 细胞的抑杀作用及其机制为其抗白血病研究提供科学依据 方法 以不同浓度钩吻总碱(、)干预 细胞 法测定其对 细胞活力的影响倒置相差显微镜观察其对
2、细胞形态的影响 染色法观察 细胞核形态变化/流式细胞术检测 细胞凋亡情况比色法测定 活性变化 检测 和 基因的表达水平 结果 钩吻总碱对 细胞抑制效果呈时间、剂量依赖性 时 为 干预 细胞后细胞形态逐渐不规则、胞质不清、胞核皱缩最终胞膜的完整性破坏 染色发现细胞体积变小整体皱缩胞核固缩、生成典型的凋亡小体 /流式细胞测定显示 细胞凋亡以早凋为主存在量效关系不同浓度钩吻总碱作用于 细胞 后 的活性提高 检测发现 干预后会下调 基因表达、上调 基因表达二者均表现出量效关系 结论钩吻总碱可能通过上调 基因表达、下调 基因表达活化 从而诱导慢性粒细胞白血病 细胞发生早期凋亡抑制其细胞活力关键词:钩吻总
3、碱慢性粒细胞白血病 细胞凋亡中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):().()./.药学研究 ./.:慢性髓系白血病()为骨髓增生性肿瘤美国 的患病率 年约为 万例以上早期预估到 年 患病率将约达 万例全球 患病率可达 万例以上可见白血病治疗药物的研发格外迫切 在关于白血病的研究中发现白血病主要是由于费城染色体中 号染色体的延长和 号染色体的缩短而促发染色体相互易位在细胞遗传学及分子生物学水平上表现出 细胞因基因易位出现 融合基因该基因表达出一种具有络氨酸激酶活性新的癌蛋白 引起下游信号通路、等的异常激活导致细胞周期异常、成熟障碍、分化受阻、增生活跃进而促进 细胞的存活和生长
4、因此白血病药物研发多围绕 融合基因展开例如:靶向蛋白激酶抑制剂伊马替尼、等但伊马替尼耐药和 对 突变体的抑制效果都不理想 而由于 在正常细胞中无表达选择性降解 是治疗 更理想和更安全的策略 由于天然产物无或少副作用因此成为癌症和传染病药物开发的宝贵来源 生物碱、类黄酮、萜类和多糖类等一系列天然产物在治疗 中表现出抗 的生物活性例如高三尖杉酯碱、粉防己碱、姜黄素等 众所周知在白血病的临床治疗中化学治疗居于主导地位中西医结合治疗亦不少见尤以砷剂治疗急性早幼粒细胞白血病备受瞩目中医学认为癌病的发病机制为正气亏虚加之气、血、痰、湿、热毒相互搏结日久结聚为癌 根据白血病的临床症状可归于“虚劳”“温病”“
5、血证”等范畴 中医学认为此病位为骨髓病变脏腑在肾病机关键为本虚标实虚实夹杂 钩吻又名苦吻、断肠草等始载于神农本草经性温味辛、苦有大毒具有攻毒散结消肿止痛的功效 现代药理学研究表明钩吻具有抗肿瘤、消炎镇痛、调节免疫等作用 基于现代医学及中医学的认识钩吻具有治疗白血病的潜力但尚未见相关报道 本研究以慢性粒细胞白血病细胞株 为细胞模型以钩吻总碱()为研究对象利用 法检测 对慢性粒细胞白血病 细胞活力的影响分析其量效时效关系通过荧光倒置相差显微镜观察、荧光染料染色、流式细胞术 /双染料实验、比色法、等方法探讨 影响慢性粒细胞白血病细胞 细胞活力的分子机制旨在为钩吻防治慢性髓系白血病的应用提供实验基础
6、实验材料.实验仪器 型 培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司)型酶标仪赛默飞世尔(上海)仪器有限公司 荧光倒置相差显微镜(日本 公司)型流式细胞仪(美国 公司)型数字超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司)型低温高速离心机(德国 公司)型 扩增仪(德国 公司).实验试剂(批号:美国 公司).胰蛋白酶(批号:)、胎牛血清(批 号:)、培 养 基(批 号:)、青链霉素(批号:)均购自美国 公司/细胞凋亡检测试剂盒(批号:大连美伦生物技术公司)磷酸盐缓冲液(批号:武汉普诺赛生命科技有限公司)逆转录试剂盒(批号:)、(批号:)均购自美国 公司 分光光度法检测试剂盒(批号:江苏凯基生物技术股份有限公
7、司)(批号:南京诺唯赞生物科技股份有限公司)蛋白定量分析试剂盒(批号:)、水(批号:)均购自上海碧云天生物技术有限公司无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷等化学试剂均为分析纯.实验细胞人慢性粒细胞白血病细胞株由中国科学院细胞库提供药学研究 .实验药物及制备钩吻总碱为福建中医药大学药学院中药萃取中心提取、纯化制备提取率约为.取适量 用二甲基亚砜()配制成浓度为 的母液于 保存给药时以含有 胎牛血清()的 培养基稀释成相应浓度 实验方法.细胞培养 人慢性粒细胞白血病 细胞以含 青链霉素、胎牛血清的 完全培养基在 环境中培养 传代 次.钩吻总碱对 细胞活力的影响 取对数生长期的 细胞计数后用 完全培养基调整细
8、胞密度为 接种于 孔培养板中(/孔)置 培养 将细胞分为:空白组(等体积完全培养基)、组(、)每组复孔 个分别干预、后每孔加入 浓度为 的 溶液培养 加入 溶液溶解结晶在 处测定各孔吸光度值计算、时 实验平行重复 次.对 细胞形态的影响取对数生长期 细胞调整细胞密度为 接种于 孔板(每孔 )培养 细胞分为空白组(等体积完全培养基)、组(、)(浓度设置根据 的 结果计算出 干预 细胞 时 为 )药物干预 后在显微镜下观察 细胞形态的改变.染色观察 对 细胞凋亡的影响 取对数生长期的 细胞调整细胞密度为 接种于 孔板(/孔)培养 细胞分为空白组(等体积完全培养基)和 组(、)各孔给予相应药物后培养
9、 离心 收集细胞加入 工作液(浓度为 甲醇稀释)进行染色再次离心收集细胞加入 的 重悬细胞吸取 各浓度组 置于 孔板中摇匀使细胞成一个细胞平面荧光倒置相差显微镜下观察并拍照实验平行重复 次.流式细胞术 /双染料实验观察 干预 细胞后的凋亡情况 将细胞密度为的对数期细胞 以/孔接种于孔板培养 细胞分为空白组(等体积完全培养基)和 组(、)各孔给予相应药物后培养 离心 弃去上清 加 入 吹 打 混 匀 后 以 离心 收集各浓度组细胞重复 次加入 的 重悬细胞将重悬液转移至流式细胞管中分别加入 、混匀室温避光反应 通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况实验平行重复 次.分光光度法检测 诱导 细胞凋亡 活性变
10、化将密度为 的对数期 细胞以 /孔接种 孔板并培养 后空白组加入等体积完全培养基 组分别加入 的含药培养基(、)干预 消化离心收集各组细胞 洗涤细胞 离心 收集细胞重复洗涤 次往细胞沉淀中加 预冷的工作液(.)反复吹打混匀将各组细胞置于冰上 使其充分裂解 离心 采用 法酶标仪上 处检测吸光度值计算出各组蛋白浓度()依照 法测得的各药物组蛋白浓度情况取总质量为 的蛋白溶液(体积为 若体积不足则用 补足)将提取的各组蛋白溶液滴加于 孔板中每孔加入含.的 后再加入 混匀后于培养箱反应 测定其吸光度计算 活性倍比关系浓度组调零组倍 比浓度组/空白组.方法检测 诱导 细胞 和 凋亡基因表达情况 各组药物
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