肺动脉高压大鼠模型中PKM2 Neddylation修饰促进右心室纤维化的研究.pdf

医学分子生物学杂志,2024,21(2):108-114 J Med Mol Biol,2024,21(2):108-114DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.02.003资助项目:甘肃省自然科学基金(No.22JR5RA012),联勤保障部队第 940 医院院内项目(No.2021yxky080)通讯作者:王金琳(电话:[phone],E-mail:1622891246 )This work was supported by grants from the Natural Science Foundation of Gansu Province(No.22JR5RA012),the Project of Joint Support Force 940Hospital(No.2021yxky080)Corresponding author:WANG Jinlin(Tel:[phone],E-mail:1622891246 )肺动脉高压大鼠模型中 PKM2 Neddylation 修饰促进右心室纤维化的研究郭文昀,王丽霞,王金琳联勤保障部队第 940 医院心血管内科 兰州市,730050【摘要】目的 探究 PKM2 拟素化(neddylation)修饰对肺动脉高压大鼠右心室纤维化的影响。方法 将SD 大鼠随机分为对照组、模型组和 MLN4924 组,HE 染色法检测肺动脉,Masson 染色检测右心室纤维化程度。提取大鼠原代心脏成纤维细胞,免疫荧光法检测-平滑肌肌动蛋白(-SMA)表达,使用 si-NC、si-PKM2、pcDNA3.1-PKM2 转染原代心脏成纤维细胞后,蛋白质免疫印迹法检测 PKM2 及纤维化相关型胶原蛋白(Collagen)、型胶原蛋白(Collagen)、基质金属蛋白酶 2(MMP2)、基质金属蛋白酶 9(MMP9)等蛋白水平。蛋白质免疫共沉淀法检测 PKM2 neddylation 修饰。实时荧光定量 PCR 法检测大鼠心脏组织中 PKM2 的 mRNA 表达水平。蛋白质免疫印迹法检测 PKM2 蛋白质降解时间。结果 HE 染色结果显示,模型组肺小动脉(纤维层)和内膜(内转运蛋白)之间的距离显著加宽,中间层的厚度增加,Masson染色显示,与对照组相比,模型组显示更多的胶原沉积,纤维化更严重的。模型组的 PKM2 蛋白表达水平高于对照组,而 mRNA 水平无显著性差异。PKM2 在大鼠肺动脉高压模型中右心室组织存在 neddylation 修饰。在心脏成纤维细胞中敲低 Nedd8 或用 MLN4924 抑制 neddylation 修饰可下调 PKM2 及纤维化相关蛋白Collagen、Collagen、MMP2、MMP9 等蛋白水平,促进 PKM2 蛋白质降解速率 (3.03 0.23)(11.97 0.66)h,t=-12.82,P0.001,过表达 Nedd8 则提高 PKM2 蛋白表达。MLN4924 组大鼠右心室纤维化程度及-SMA 蛋白表达水平低于模型组。结论在肺动脉高压大鼠模型中,neddylation 修饰增强了PKM2 的蛋白质稳定性进而促进右心室纤维化过程。【关键词】肺动脉高压;PKM2;拟素化修饰;右心室纤维化【中图分类号】R392.11Effect of PKM2 Neddylation Modification on Right Ventricular Fibro-sis in Pulmonary Hypertension RatsGUO Wenyun,WANG Lixia,WANG JinlinDepartment of Cardiovascular Medicine,Joint Support Force 940th Hospital,Lanzhou,730050,China【Abstract】Objective Exploring the effect of PKM2 neddylation modification on myocardial fi-brosis in pulmonary hypertension rats.Methods SD rats were randomly divided into 3 groups:con-trol group,model group,and MLN4924 group.Pulmonary arteries were detected by HE staining,and right ventricular fibrosis was detected by Masson staining.Primary cardiac fibroblasts were isola-ted from rats and the expression of-Smooth muscle actin(-SMA)was measured by immunofluo-rescence assay.The si-NC,si-PKM2,and pcDNA3.1-PKM2 were transfected into the primary car-diac fibroblasts and the expression levels of PKM2,fibrosis related proteins Collagen,Collagen,MMP2,and MMP9 were detected by Western blotting.Immunoprecipitation assay was used todetect the PKM2 neddylation modification.Real time fluorescence quantitative PCR method was usedto detect the mRNA expression level of PKM2 in the rat heart tissues.The degradation of PKM2 pro-tein was detected by Western blotting,and the half-life of PKM2 was determined.Results The HEstaining results showed that the space between pulmonary arterioles(fibrous layer)and intima(in-ner transport protein)in the model group was significantly widened and the intermediate layer werethickened.Masson staining showed that the collagen deposition was increased and the fibrosis wasmore severe in the model group when compared with those in the control group.The expression levelof PKM2 protein in the model group was higher than that in the control group,while there was nosignificant difference in the mRNA expression level.PKM2 underwent neddylation modification in theright ventricular tissues of pulmonary hypertension rats.Knocking down Nedd8 in cardiac fibroblastsor inhibiting neddylation modification with MLN4924 could downregulate the expression levels ofPKM2 and fibrosis related proteins Collagen,Collagen,MMP2,MMP9,etc.,promotingthe degradation of PKM2 protein (3.03 0.23)-(11.97 0.66)h,t=-12.82,P 0.001.However,the overexpression of Nedd8 could increase the expression level of PKM2 pro-tein.The degree of right ventricular fibrosis and the expression level of-SMA protein in theMLN4924 group were lower than those in the model group.ConclusionNeddylation modificationenhances the protein stability of PKM2,thereby promoting the process of right ventricular fibrosis inthe rat model of pulmonary arterial hypertension.【Key words】pulmonary arterial hypertension;PKM2;neddylation;right ventricular fibrosis 肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是一种常见的合并疾病,可显著恶化多种疾病患者的发病率和死亡率1。PAH 患者严重心室纤维化,其特征是内皮-间充质转换和胶原生成增加引起的心脏纤维化2。有研究表明肺动脉高压右心室成纤维细胞表观遗传代谢重编程在心肌纤维化中发挥重要作用,其中线粒体代谢中的丙酮酸脱氢酶激酶依赖性改变会促进右心室纤维化3。M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2),被鉴定为厌氧代谢、氧化应激、组织炎症和纤维化的分子整合因子,并且参与肺动脉高压疾病进程中4。Shimauchi 等5发现过度激活的 PARP1 通过促进PKM2 的表达和核功能、糖酵解基因的表达、核因子 B 依赖性促炎因子的激活来促进心肌细胞功能障碍。Li 等6研究表明,紫草素抑制 PKM2 的表达有助于改善野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导的 PAH 大鼠肺血管重塑。蛋白表达异常升高在多种疾病及肿瘤进程中发挥作用,而蛋白质翻译后修饰在蛋白质质量调控中发挥关键作用7。拟素化(neddylation)修饰作为类泛素化修饰参与细胞生理过程中,其异常激活在许多类型的癌症细胞中发现8。同时针对拟素化修饰过程中的 DCN1-UBC12 相互作用开发的抑制剂可有效抑制心脏纤维化的发生9。然而在肺动脉高压大鼠模型中PKM2 neddylation 修饰与右心室纤维化的关系未见报道,故本文将探究 PKM2 neddylation 修饰在肺动脉高压大鼠模型中促进右心室纤维化的机制。1 材料与方法1.1 实验试剂MLN4924(pevonedistat,HY-70062)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,HY-Y0320)、野百合碱(monocrotaline,MCT,HY-N0750)、放线菌酮(cycloheximide,CHX,HY-12320)购 买 自MCE。胎牛血清购买自 Hyclone 公司,DMEM 培养基及胰酶购买自凯基生物,总 RNA 提取试剂 TR-Izol 购自美国 Invitrogen 公司,qPCR 引物由金唯智生物科技有限公司合成。PKM2 过表达载体 pcD-NA3.1-PKM2,si-PKM2(siRNA-PKM2)、si-NC(siRNA-negative control)购买自上海吉玛公司,Lipofectamine 3000 购自赛默飞公司,一抗 GAPDH(#5174)、PKM2(#4053)购买自 CST。Collagen(ab138492)、Collagen (ab184993),MMP2(ab92536),MMP9(ab76003)均购买自 Abcam 公司。1.2 动物分组及给药将 60 只体重相似的雄性 SD 大鼠随机分为对照组、模型组、MLN4924 组,每组 20 只大鼠。对照组腹腔注射生理盐水,模型组和 MLN4924 组大鼠经腹腔注射 1%MCT 溶液 60 mg/kg10,连续 4周通过单次腹腔注射野百合碱建立肺动脉高压模型,同时 MLN4924 组大鼠额外连续灌胃(10 mg/kg)。所有动物实验均经我院伦理委员会批准。1.3 原代心脏成纤维细胞提取大鼠原代心脏成纤维细胞的提取。根据先前的研究11-13,取成年 SD 大鼠,取出心脏组织。分散成单细胞悬液后,将培养瓶置于 37 和 5%CO2的培养箱中,并进行 50 60 min 的粘附。心肌细胞比心脏成纤维细胞更慢地粘附在壁上,因此心肌细胞和心脏成纤维细胞可以分离。取出培养瓶并轻轻摇动数次。将含有心肌细胞的悬浮液转移到 50mL 离心管并以 1 000 r/min 离心 10 min。丢弃上清液,并将细胞重悬于补充有BrdU 的10%FBS-DMEM中。24 h 后,更换接种的细胞,用 PBS 洗涤两次,以901医学分子生物学杂志,2024,21(2):108-114 J Med Mol Biol,2024,21(2):108-114去除死细胞和未附着的细胞。从原代培养中获得的非心肌细胞中,在2 3 代后,95%以上是心脏成纤维细胞。在无血清饥饿的情况下,在细胞达到二次融合后24 h 取心肌成纤维细胞进行实验。1.4 细胞转染大鼠原代心脏成纤维细胞生长至对数生长期时用胰酶消化、计数,然后接种于6 孔板,培养24 h以备转染。严格按照 Lipofectamine 3000 试剂盒说明书 将 转 染 pcDNA3.1 空 载、pcDNA3.1-PKM2、siNC、siPKM2 大鼠成纤维细胞,转染 48 h 后提取各组细胞总蛋白。1.5 免疫荧光检测-SMA 蛋白取对数生长期的成纤维细胞,铺于激光共聚焦培养皿中,生长 24 h 后。用 PBS 清洗 2 3 次。4%多聚甲醛固定 30 min,并用 PBS 漂洗 3 次,每次 5 min。然后,使用 0.5%Triton X-100 在 37 下渗透30 min。用 PBS 冲洗后,用5%BSA 在37 下密封 1 h,将-SMA 抗体在4 下孵育过夜,并用 PBS 冲洗3 次,每次5 min。然后,将二抗在37 下孵育90 min。DAPI 在37 染色10 min。封片后并在激光共聚焦荧光显微镜(LSM700)下观察。1.6 qPCR 检测 PKM2 的表达TRIzol 法提取对照组和模型组大鼠右心室组织中总 RNA,2%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的纯度,随后逆转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA),1 gcDNA 为模板进行 qPCR,反应体系(20 L):2L cDNA、10 L SYBR Green Mix、上下游引物(10 mol/L)各0.8 L、6.4 L dH2O。预变性95、30 s,94 变性30 s、60 退火30 s、72 延伸1min,循环 45 次后进行终延伸完成 PCR。采用2-Ct法计算目的基因(PKM2)表达。以 GAPDH为内参,引物序列见表 1,实验独立重复 3 次。表 1 qPCR 引物序列引物名称序列(53)GAPDHF:GAGCACAGAGCCTCGCCTTTR:AGACAAAGACCCCGCCGGTTPKM2F:TCCCGAGAAAAGATTAGTCAGCAR:AGTGGGGCACCTGTTTAACTT 1.7 蛋白质印记法检测 PKM2 及纤维化相关蛋白表达取各组细胞,离心 5 min,PBS 溶液洗涤 3 次。提取各组细胞总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度。每组取 30 g 进行 SDS-PAGE 分离蛋白条带,用电转移法将目的蛋白转移至 PVDF 膜上,5%脱脂奶粉室温封闭 2 h,加入一抗(1 1 000),4 过夜孵育;次日,PBST 洗涤 3 次,加入 HRP 标记的二抗(110 000),室温孵育 2 h;PBST 洗涤 3 次后加入ECL 化学发光液进行显影,最后凝胶成像仪上观察拍照。1.8 蛋白免疫共沉淀收集培养的状态良好的大鼠心脏成纤维细胞。加入适量预冷的细胞裂解液冰浴裂解 10 min,12 000 r/min 离心 10 min,收集上清总蛋白。测定蛋白浓度。调整蛋白浓度为 1 mg/mL,分组分别加入对应抗体(PKM2 或 Nedd8 2.5 L)和 Protei-nA/G(50 L)包被的琼脂糖珠于4 过夜孵育结合,次日用 PBS 充分洗涤 3 次,每个样品加入 50L 1 buffer(蛋白上样缓冲液),沸水浴 5 min。随后使用对应抗体进行蛋白质免疫印迹。1.9 免疫组化实验大鼠肺动脉和心脏分别做石蜡切片。切片在60 的微波炉中烘烤 2 h。然后,将切片置于二甲苯中15 min,共3 次。然后,将它们用蒸馏水浸泡5 min,用苏木精染色 3 min,用蒸馏水漂洗,并用PBS 返回蓝色。伊红染色 5 s 后,用去离子水冲洗,并用酒精(95%100%)脱水 5 min。将样品取出并置于二甲苯中 10 min;用中性树胶密封;并在显微镜(BA210T,Motic)下观察。1.10 Masson 染色实验石蜡切片取自大鼠右心室。将切片脱蜡到水中,抖落切片上的水,并加入适量的核染料以覆盖整个组织,染色持续3 5 min。然后,用自来水完全冲洗染色溶液,用蒸馏水浸泡切片,然后用弱碱性溶剂 PBS 浸泡切片 10 min,使细胞核变蓝。随后从切片中去除水分,加入适量的纸浆染料覆盖整个组织,染色 2 min,并用漂洗液和彩色分离液漂洗染料约 30 s。加入适量的红细胞溶液覆盖整个组织后,将其染色6 8 min。将样品吹干并透明,用中性树胶密封,并在显微镜(BA210T,Motic)下观察。1.11 统计学分析SPSS 20 软件进行实验数据分析,GraphPad7.0 软件进行相关图片绘制。所有实验独立重复 3次,数据代表平均值 标准差,数据服从正态分布,两组间比较,采用均值独立样本 t 检验,以 P0.05 表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 PKM2 在肺动脉高压大鼠右心室中呈高表达肺动脉的免疫组织化学染色结果显示,模型组011郭文昀,等.肺动脉高压大鼠模型中 PKM2 Neddylation 修饰促进右心室纤维化的研究肺小动脉(纤维层)和内膜(内转运蛋白)之间的距离显著加宽,中间层(平滑肌层)的厚度增加,中间面积占肺小动脉总截面积的比例增加,这表明成功建立 PAH 模型(图 1A)。同时我们对大鼠右心室 Masson 染色显示,与对照组相比,模型组显示更多的胶原沉积,表明产生更严重的纤维化(图 1B)。蛋白质免疫印迹实验分析大鼠右心室发现,相对于对照组,PKM2 在模型组大鼠中蛋白表达水平升高(图 1C)。但是实时荧光定量 PCR 检测发现,PKM2 mRNA 水平在模型组与对照组之间没有差异(图 1D)。上述结果表明,成功建立大鼠肺动脉高压模型,右心室出现明显纤维化现象,并且在肺动脉高压模型大鼠右心室中 PKM2 蛋白水平高表达。A:肺动脉 HE 染色(40);B:右心室 Masson 染色(上图 40,下图 200);C:蛋白质免疫印迹检测右心室PKM2 蛋白水平;D:实时荧光定量 PCR 检测右心室 PKM2 mRNA 水平。图 1 PKM2 在肺动脉高压大鼠右心室中呈高表达2.2 PAH 模型组大鼠右心室中 PKM2 存在 Neddylation 修饰 蛋白质翻译后修饰对蛋白质量调控发挥着重要的作用,鉴于 PKM2 在 PAH 模型组小鼠中蛋白水平升高而 mRNA 水平无变化,我们考虑是否存在翻译后修饰调控 PKM2 蛋白的稳定性。通过 NCBI数据库查询发现,PKM2 与 neddylation 修饰系统蛋白存在密切联系(如 UBE2M,UBA2 等)。故我们猜测,PKM2 可能存在 neddylation 修饰。蛋白质免疫印迹检测结果发现,使用模型组和对照组大鼠右心室组织蛋白裂解液与 Nedd8 抗体免疫共沉淀,随后使用 PKM2 抗体进行免疫显色,我们发现相较于对照组,模型组在 PKM2 蛋白上方出现了经典的多条蛋白质修饰条带(图 2A),同时也使用模型组和对照组大鼠右心室组织蛋白裂解液与 PKM2 抗体免疫共沉淀,随后使用 Nedd8 抗体进行免疫显色,同样的模型组在 PKM2 蛋白上方出现了经典的多条蛋白质修饰条带,而对照组未发现(图 2B)。上述结果表明,在 PAH 模型组大鼠右心室组织中PKM2 存在 neddylation 修饰。A:对照组与模型组大鼠右心室组织裂解液与 anti-Nedd8 进行免疫共沉淀,anti-PKM2 进行蛋白质免疫印迹;B:对照组与模型组大鼠右心室组织裂解液与 anti-PKM2 进行免疫共沉淀,anti-Nedd8 进行蛋白质免疫印迹。图 2 PAH 模型组大鼠右心室中 PKM2 存在 neddylation 修饰2.3 Neddylation 修饰促进 PKM2 蛋白质稳定性为进一步探究 PKM2 neddylation 修饰的功能,我们提取了 PAH 模型组大鼠右心室原代心脏成纤维细胞。通过 siRNA 干扰心脏成纤维细胞中 Nedd8的表达,蛋白质免疫印迹实验结果显示,siNedd8组 PKM2 蛋白水平低于 siNC 组(图 3A)。此外使111医学分子生物学杂志,2024,21(2):108-114 J Med Mol Biol,2024,21(2):108-114用 neddylation 抑制剂 MLN4924 处理细胞,结果显示,MLN4924 组的 PKM2 蛋白表达水平低于 DMSO组(图 3B)。蛋白质免疫印迹实验结果显示,OE-Nedd8 组的 PKM2 蛋白水平高于 OE-NC 组(图3C)。蛋白质稳定性实验结果显示,MLN4924 组(3.03 0.23)h 的蛋白降解时间显著短于 DM-SO 组 (11.97 0.66)h,t=-12.82,P 0.001(图 3D),上述结果表明,在 PAH 模型组大鼠中敲低 Nedd8 降低心脏成纤维细胞 PKM2 蛋白水平,过 表 达 Nedd8 则 提 高 PKM2 蛋 白 水 平,MLN4924 处理心脏成纤维细胞后 PKM2 蛋白水平下降,MLN4924 处理缩短了 PKM2 蛋白质降解时间。A:蛋白质免疫印迹法检测 siNC/siNedd8 组 PKM2 蛋白水平;B:蛋白质免疫印迹法检测 DMSO/MLN4924 组PKM2 蛋白水平;C:蛋白质免疫印迹法检测 OE-NC/OE-Nedd8 组 PKM2 蛋白水平;D:检测 DMSO/MLN4924 组PKM2 蛋白质降解。图 3 Neddylation 修饰促进 PKM2 蛋白质稳定性2.4 PKM2 Neddylation 修饰调控心脏成纤维细胞纤维化相关蛋白表达 为进一步理解 PKM2 蛋白 neddylation 修饰与右心室纤维化的关系,我们对心脏成纤维细胞中纤维化相关蛋白进行了检测。蛋白质免疫印迹实验结果显示,相较于 siNC 组,siNedd8 组中纤维化相关蛋白 Collagen、Collagen、MMP2、MMP9 蛋白表达水平偏低(图 4A)。同时使用 neddylation 抑制剂 MLN4924 处理细胞 24 h 后,Collagen、Colla-gen、MMP2、MMP9 蛋白表达水平明显低于DMSO 组(图 4B)。上述结果表明,通过敲低Nedd8 或者添加 MLN4924 来抑制 PKM2 的表达水平均可以成功降低纤维化相关蛋白 Collagen、Collagen、MMP2、MMP9 蛋白表达。A:蛋白质免疫印迹法检测 siNC/siNedd8 组 PKM2、Collagen、Collagen、MMP2、MMP9 蛋白水平;B:蛋白质免疫印迹法检测 DMSO/MLN4924 组 PKM2、Collagen、Collagen、MMP2、MMP9 蛋白水平。图 4 PKM2 neddylation 修饰调控心脏成纤维细胞纤维化相关蛋白表达2.5 MLN4924 减弱 PAH 大鼠模型中右心室纤维化为考量 PKM2 neddylation 修饰对 PAH 大鼠模型中右心室纤维化的总体影响,我们使用 neddyla-tion 特异性抑制剂 MLN4924 处理 PAH 大鼠模型。Masson 染色显示,相对于对照组,模型组大鼠右心室 胶 原 沉 积 增 加,纤 维 化 程 度 严 重,但 是MLN4924 组较模型组纤维化程度显著降低(图5A)。211郭文昀,等.肺动脉高压大鼠模型中 PKM2 Neddylation 修饰促进右心室纤维化的研究此外,提取 3 组大鼠的原代心脏成纤维细胞,免疫荧光实验结果显示,模型组的纤维化指标-SMA 蛋白显著高于对照组,然而 MLN4924 组-SMA 蛋白低于模型组(图 5B)。上述结果表明,MLN4924 处理可以降低 PAH大鼠模型中右心室纤维化程度。A:Masson 染色检测对照组/模型组/MLN4924 组大鼠右心室纤维化(上图 40,下图 200);B:免疫荧光法检测对照组/模型组/MLN4924 组大鼠心脏成纤维细胞-SMA 蛋白表达水平(200)。图 5 MLN4924 减弱 PAH 大鼠模型中右心室纤维化3 讨论PAH 是一种具有癌症样表型的致命性心血管疾病14。据报道,缺氧性 PAH 的右心室心肌纤维化与局部肾素-血管紧张素系统激活有关15。在严重的右心室功能障碍中,肌原纤维和纤维化介导的硬度都会增加右心室心肌硬度16。先前的研究称,PKM2 通过将细胞代谢状态转化为有氧糖酵解,即促进细胞增殖的 Warburg 效应,对 PAH 发挥关键作用17。Warburg 代谢及其表观遗传学调节因子是PAH 的高价值治疗靶点。PKM2 的抑制通过减弱内皮细胞和外膜成纤维细胞的增殖来减轻缺氧性PAH18。本文研究发现 PAH 模型组大鼠中 PKM2蛋白表达显著升高,且与右心室纤维化程度有关,然而 PKM2 的蛋白水平升高与其 mRNA 水平无关,表明 PKM2 蛋白质翻译后修饰负责肺动脉高压大鼠模型中 PKM2 的升高。PKM2 已被发现存在多种翻译后修饰,如磷酸化19、乙酰化20、SUMO 酰化21、糖基化等22,进而调控 PKM2 的活性,蛋白亚细胞定位,蛋白质结构变化等,然而对于PKM2 蛋白稳定性的修饰还未见报道。本研究通过分析 NCBI 数据库中 PKM2 的蛋白相互作用关系发现,PKM2 与多个 neddylation 修饰系统蛋白存在相互作用,如 UBE2M,UBA2 等,所以 我 们 猜 测PKM2 可能存在 neddylation 修饰,通过蛋白质免疫共沉淀实验发现,相较于对照组,肺动脉大鼠模型右心室组织中 PKM2 存在显著的 neddylation 修饰。说明 PKM2 的 neddylation 修饰与右心室纤维化有着密切联系。Neddylation 修饰作为重要的翻译后修饰,对于维持细胞正常生理功能有着至关重要的作用,而异常升高的 neddylation 修饰水平参与多种癌症的发生发展23。蛋白质发生 neddylation 修饰,通常改变其蛋白质稳定性,蛋白亚细胞定位,蛋白-蛋白相互作用等功能24。本研究发现,对 neddylation 系统的 Nedd8 基因敲低后,PKM2 的蛋白水平大幅下调,并且使用 neddylation 特异性抑制剂也可大幅下调 PKM2 的蛋白水平,然而当过表达 Nedd8 时,则上调 PKM2 蛋白表达,这些结果说明 neddylation 正向促进 PKM2 蛋白表达。为进一步的探究 neddyla-tion 是否调控 PKM2 蛋白稳定性,我们使用 CHX抑制细胞蛋白质合成,进而通过 MLN4924 抑制PKM2 的 neddylation 修饰,结果显示 MLN4924 组PKM2 蛋白降解时间显著低于 DMSO 组,表明了neddylation 修饰可以维持 PKM2 蛋白质稳定性,抑制其降解。先前的研究表明 neddylation 参与调控心脏纤维化的发生,抑制 neddylation 修饰可有效的减弱心脏纤维化的发生25。本研究发现,通过基因手段干扰或者药物手段抑制 neddylation 修饰可以显著下调心脏成纤维细胞中 PKM2 蛋白水平,并且纤维化相关蛋白,型胶原蛋白,型胶原蛋白,基质金属蛋白酶 2,基质金属蛋白酶 9 等蛋白水平也大幅度下调。我们进一步分析对照组、模型组、MLN4924组大鼠右心室纤维化程度时发现,模型组大鼠右心室纤维化程度高于对照组,而 MLN4924 组的纤维化程度比模型组显著降低。同时心肌成纤维细胞免疫荧光实验发现,MLN4924 组的-平滑肌肌动蛋白水平显著低于模型组细胞。这些结果说明,抑制PKM2 的 neddylation 修饰可有效改善肺动脉大鼠模311医学分子生物学杂志,2024,21(2):108-114 J Med Mol Biol,2024,21(2):108-114型中右心室纤维化。综上所述,本文研究表明在肺动脉高压大鼠模型中,neddylation 修饰增强了PKM2 的蛋白质稳定性进而促进右心室纤维化过程。参考文献1 HOEPER M M,BADESCH D B,GHOFRANI H A,et al.Phase 3 trial of sotatercept for treatment of pulmonary ar-terial hypertensionJ.N Engl J Med,2023,388(16):1478-1490.2 AL-QAZAZI R,LIMA P D A,PRISCO S Z,et al.Macro-phage-NLRP3 activation promotes right ventricle failure inpulmonary arterial hypertension J.Am J Respir CritCare Med,2022,206(5):608-624.3MASSON B,LE RIBEUZ H,SABOURIN J,et 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