基于ITS和RLKs序列的苦荞种质资源遗传多样性分析.docx
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1、 基于ITS和RLKs序列的苦荞种质资源遗传多样性分析 张久盘 常克勤 杨崇庆 穆兰海 杜燕萍摘 要 为明确苦荞资源的遗传多样性水平及遗传关系,对45份苦荞地方品种的ITS和RLKs序列进行基因测序和序列比较分析。结果显示,苦荞ITS和RLKs扩增序列较为保守,基因多态位点数分别占10.6%和7.7%。云贵川地区苦荞材料的遗传多样性最丰富,陕西、山西及宁夏地区次之,甘肃及内蒙古地区最低。四川和贵州地区的苦荞品种均能够单独聚为一类,基于ITS序列构建的NJ树中,陕西地区以北的苦荞品种未形成明显的分支,而云南地区的苦荞穿插在不同的分支中;基于RLKs基因构建的NJ树中,同一地区的苦荞材料较为明显地
2、形成地域聚类,但自展值均较低。关键词:苦荞;遗传多样性;ITS;RLKs荞麦(Fagopyrum tataricum)又称乌麦、三角麦、花荞、荞子,属于蓼科(Polygnaceae)荞麦属(Fagopyrum),起源于我国西南地区1。目前,发现荞麦共有28个种、亚种和变种,而荞麦栽培种仅有甜荞和苦荞,其生物学特征及栽培适宜区域均有所不同2。荞麦营养成分均衡,富含赖氨酸3-5及黄酮类化合物,具有降低“三高”、软化血管、保护视力和预防脑溢血的作用6-7,是药食兼用的保健和功能产品。由于荞麦具有抗逆性强、适应性广、耐瘠薄耐粗放等优点,成为生产条件较差的地区大量种植的粮食作物。过去国内外学者多采用形态
3、学标记、细胞学标记、种子蛋白标记和同工酶标记等方法对荞麦亲缘关系及遗传多样性进行分析,但分子标记技术已成为近年来最主要的种质资源遗传多样性分析手段,国内外广泛使用RAPD、AFLP、SSR等分子标记来评价荞麦遗传多样性。胡亚妮等8基于ITS和ndhF-rpl32序列构建的进化树将71份荞麦材料分为大粒组和小粒组,而ndhF-rpl32序列构建的进化树还能区分栽培甜荞和野生甜荞,具有更好的聚类效果。李敏等9利用PAL基因将67份苦荞地方品种分为7个类群,分类与地理类群无关,仅来源于西藏的5份材料单独聚为一枝;PAL基因在苦荞中遗传较稳定,多数材料之间变化差异较小,在西藏部分材料中可能存在突变的热
4、点区。梁成刚等10研究表明荞麦属MAPK基因序列高度保守,通过聚类分析发现野生甜荞与左贡野荞被聚为一类,野生苦荞、毛野荞、大野荞、金荞麦、细柄野荞和硬枝万年荞被聚为一大类。本研究以45份苦荞为试验材料,通过PCR直接测序的方法获得ITS和RLKs基因序列,进行序列差异和聚类分析,阐明苦荞地方品种的遗传多樣性水平,旨在揭示我国苦荞种质资源间的遗传关系,为苦荞种质资源的收集、保护、利用提供依据。1 材料与方法1.1 试验材料试验材料为苦荞地方品种,共45份,分别收集自四川、贵州、云南及宁夏等8个省份(自治区),供试材料的代码、名称及来源见表1。1.2 试验方法1.2.1 DNA提取采集供试材料34
5、片叶龄时的嫩叶0.5 g,利用Tiangen公司植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)提取样本DNA,用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测DNA的纯度和浓度。1.2.2 PCR扩增、测序用于扩增目的片段ITS和RLKs的引物序列如下。ITS: F5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3,R5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3。RLKs:F5-GT-GTTGCTCACCAGTTGGATT-3,R5-TTC-TATCCAGTGGGGTGACTG-3。引物序列由北京擎科生物技术有限公司合成。PCR反应体积20 uL,包括2Taq PCR预混试剂2.8 uL、10 mM引物各0.6
6、 uL、DNA模板1 uL、ddH2O 15 uL。PCR反应程序:95 预变性3 min;94 变性30 s,54 /56 (ITS/RLKs)退火30 s,72 延伸90 s,共30个循环;72 延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送至北京擎科生物有限公司进行测序。1.2.3 数据分析通过Chromas 1.45软件获得原始序列数据,用ClustalX 1.83程序对测得的DNA序列进行比对,并加以人工校对,用DnaSP 5.1软件11统计多态位点。用Modeltest 3.06软件12选择2个基因片段核苷酸的最佳替换模型,根据最佳替换模型运用Mega 5.0软件13
7、进行遗传多样性指数、差异位点的统计分析及遗传距离的计算。基于Jukes-Cantor距离法,进行1 000次自展重复检测支持率,构建Neighbor-Joining(邻接法)系统发育树。2 结果与分析2.1 ITS和RLKs序列特征及遗传多样性参数分析经PCR扩增、测序分别获得43条ITS和45条RLKs同源序列。经过DNA序列比对,切除两端引物序列后,获得ITS和RLKs同源序列片段长度分别为539 bp和815 bp。利用MEGA 5.0和DnaSP 5.1软件对ITS、RLKs序列数据进行分析,在ITS序列539个位点中,变异位点为57个,基因多态位点百分比为10.6%;在815 bp的
8、RLKs序列矩阵中,变异位点63个,基因多态位点百分比为7.7%。苦荞各地方品种两序列的变异信息及遗传多样性参数见表2。不同地区的苦荞品种ITS序列的核苷酸多样度的变化范围为0.001 90.010 5,平均杂合度的变化范围为0.001 90.015 1;RLKs基因的核苷酸多样度的变化范围为0.002 20.009 0,平均杂合度的变化范围为0.002 40.012 2。从ITS和RLKs序列的值和值看出,贵州、四川和云南地区苦荞材料的遗传多样性最丰富,陕西、山西及宁夏地区次之,甘肃及内蒙古地区的苦荞材料的遗传多样性最低。2.2 基于ITS和RLKs序列的苦荞组内及组间遗传距离分析利用MEG
9、A 5.0软件,基于Jukes-Cantor距离模型分析ITS和RLKs序列数据,将来源相同省(自治区)的苦荞品种进行分组,得到不同地方来源苦荞的组内平均遗传距离(表3)及组间平均遗传距离(表4)。由表3和表4可知,基于ITS序列的组内遗传距离为0.0020.011,贵州、四川及陕西苦荞材料组内遗传距离相对较大;内蒙古与云南、四川地区的苦荞材料组间遗传距离较大,陕西与云南地区、内蒙古与贵州地区的苦荞材料组间遗传距离次之。基于RLKs序列组内遗传距离为0.0020.010,贵州、四川及云南苦荞材料组内遗传距离相对较大;内蒙古与云南地区、四川地区的苦荞材料组间遗传距离较大,陕西与云南地区的苦荞材料
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