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胚挽救技术应用于无核葡萄育种的研究进展

范春霞 周 燕 高述民 张小方
摘要植物的胚挽救技术在无核葡萄的育种研究中发展迅速,通过对胚挽救技术及其在无核葡萄育种上的应用以及影响胚挽救的因素进行综述,指出了葡萄胚挽救技术存在的不足,并对其今后研究方向提出展望。
关键词 胚挽救技术;无核葡萄育种;应用;研究进展
S663.1A 1007-5739(2009)09-0019-02
无核鲜食葡萄（Vitis vinifera L．）一直深受广大消费者的喜爱。无核性状作为葡萄重要的商品性状是当前葡萄育种的重要目标之一。20世纪以有核品种为母本的有性杂交方式选育效益很低，随着胚挽救技术的应用，极大地缩短了无核葡萄选育的育种周期，使无核葡萄的育种有了长足地发展。将胚挽救技术用于无核葡萄育种是十分有效的，并为解决无核葡萄育种中的问题开辟了新思路。
1无核葡萄的胚挽救技术
无核葡萄根据其授粉结实的特性可分为2类：一类称单性结实型（Parthenocarpy），就是卵细胞不经过受精作用而直接发育成果实；另一类称假单性结实型（Pseudo-Parthen-ocarpy），即种子败育型（Stenospermocarpy），就是虽受精，但受精后的胚很快停止发育导致无核果实产生，这种类型的品种占无核品种的85%以上。
胚挽救技术就是通过选择假单性结实类型的无核品种，在其合子胚败育之前进行人工离体培养，减少幼胚的败育，利用胚乳及培养基中的营养使其发育成充实的胚，最终形成完整的植株。之前，以有核材料（母本）×无核材料（父本）的杂交方式培育的无核葡萄品种的无核比率很低，且选育1个品种的周期非常长（10年以上）。现利用胚挽救方法可进行“无核×无核”方式杂交，通过胚挽救其后代来培育无核品种，并结合现代生物技术，从而使无核比率成倍提高，且大大缩短了品种的选育时间。
2胚挽救技术在无核葡萄育种上的应用
2.1培育无核葡萄品种
无核葡萄品种间杂交或以无核葡萄品种作母本进行杂交是培育无核葡萄品种的有效途径，而胚挽救技术使这种杂交方式成为现实。从Ramming等首次报道利用胚挽救技术获得无核葡萄实生苗以来，世界各国利用该方法相继获得了许多无核葡萄新资源，且选育出优良的无核葡萄品种。并通过深入研究基因型、培养基、取样时期以及它们间的相互作用对无核葡萄胚珠培养的影响，建立了辅助无核葡萄育种的胚挽救技术程序[1]。我国自20世纪90年代后也相继开展了此项研究，并打下了一定的实践基础。程和禾等[2]通过对接种时期、基本培养基和激素配比、低温等因素的研究，建立了较为简单实用的奥迪亚无核葡萄幼胚抢救体系，为奥迪亚无核葡萄作母本进行杂交育种奠定了技术基础。唐冬梅、闫爱玲等通过大量试验对胚挽救的多个影响因素进行了进一步地研究和验证，更加完善了胚挽救技术在无核葡萄育种上的辅助应用程序[3，4]。
2.2克服杂交不亲和
远缘杂交是将野生种抗性基因组转移至栽培品种，或将不同种的优良基因重组的一种有效育种方式。由于远缘杂交杂种胚、胚乳和子房组织间缺乏协调性，致使杂种胚部分或全部坏死，有时受精后的幼胚不发育或中途停止发育，导致难以获得杂种苗。胚挽救技术在克服远缘杂交的不亲和性方面发挥了巨大的作用[1]。Goldy和Ramming等首先通过胚挽救技术，分别获得了多株胚挽救苗。我国首次利用无核葡萄×中国野生葡萄杂交结合胚挽救技术，获得51株杂种后代。李金月等[5]用无核葡萄与抗性强的有核葡萄杂交获得无核、抗性强、可利用的杂种后代，改变了无核葡萄抗性差的弊端。可见，胚挽救技术是克服远缘杂交不育的一种有效方法。
2.3三倍体育种
三倍体育种是获得优质大粒、抗病及抗逆性好的无核葡萄品种的重要途径之一。获得三倍体无核葡萄，最有希望的方法是二倍体与四倍体间的杂交。郭印山等对二倍体与四倍体葡萄杂种胚珠采取横切的方法获得了三倍体植株，并采用L25（55）的正交试验证明了影响胚挽救成苗率最重要的是接种时间， 然后是各种植物激素的浓度[6]。而闫爱玲等[4]以二倍体葡萄为母本，与四倍体葡萄杂交，杂种进行胚珠培养，获得了三倍体植株，并通过试验确定了不同成熟期胚挽救的取样时期可以根据母本品种成熟期来确定。
2.4分子标记技术辅助无核葡萄育种
分子标记是DNA水平的标记，能够稳定遗传，可以反映生物个体和群体特性。由于常规育种中对目标性状选择耗时、费力且容易出现偏差，因此分子标记在葡萄育种中的应用将提高葡萄遗传育种的效率和精确度，并可用于杂种后代的无核性、抗病性及抗寒性等品种的早期鉴定。有研究者先后采用RAPD方法及AFLP技术法对葡萄无核基因进行了研究。Scott等[7]首次利用AFLP技术对Flame seedless 的突变体进行早期鉴定。郭海江等[8]利用葡萄无核基因、抗黑痘病和抗炭疽病基因RAPD标记，对多个胚挽救杂交后代进行了抗病性辅助选择。李金月等[5]对供试材料进行RAPD分子标记，以验证供试材料的抗寒性。这些研究成果为分子标记辅助早期选择无核葡萄育种提供了DNA依据。
3无核葡萄胚挽救育种的主要影响因素
3.1确定最佳胚挽救时期
为保证获得杂交后的合子胚，一定要用假单性结实的无核葡萄作母本。在亲本选择时除保证无核性状外，选择并培育抗病、早熟大粒、抗逆性强等优良性状是目前的育种方向。无核葡萄胚的发育受基因型的严格控制。不同品种，甚至同一品种的不同植株，同一植株的不同部位，其胚发育期的长短是不同的。因此，研究胚败育的过程，确定胚珠接种的最佳时期是胚挽救成功的前提[8]。有研究者通过无核葡萄与有核葡萄胚挽救杂交后代的抗寒性研究，证实了葡萄抗寒性具有母性遗传现象。因此，在进行葡萄的抗寒性杂交选育中，一定要注意亲本特别是母本的选配[5]。
3.2培养基及激素的选择
无核葡萄胚挽救中选择适宜的培养基是获得成功的关键环节。在胚挽救过程的不同培养阶段所选用的基本培养基类型不同。在胚珠培养阶段，大多数研究者认为Nitsch 或NN 为胚发育的基本培养基效果良好，并经过多年研究总结出了适合无核葡萄胚珠培养的ER培养基。在胚萌发和成苗培养阶段，多数研究者认为1/2MS 或Wood Plant（WP）培养基较好。经研究比较ER和Nitsch 两种固液双层胚珠发育培养基对胚珠萌发的效果，结果发现后者更适宜于无核葡萄杂种胚的萌发和胚状体发生[9]。因此，在胚挽救过程中，注意基本培养基应随着胚的不同发育阶段而进行及时更换。在胚挽救中，无核葡萄胚珠培养适合在较高的铵态氮的培养基上，在培养基中适当添加活性炭和0.2~0.5mg/L的BA对无核葡萄的胚珠发育有促进作用。为打破胚的休眠，可加入适宜浓度的GA和IAA取代低温处理。诱导分化阶段可加入6－BA和NAA。在幼胚生长中，附加碳水化合物如葡萄糖和果糖等，既可提高培养基的渗透压，还可为胚的发育提供能量，对胚性生长有利，但后期胚的萌发需降低渗透压。切开胚珠可以改善胚与培养基之间的物质交流，横切的胚珠培养萌发率最高[10]。此外，培养条件的设置对于胚挽救也有一定的影响。如合适的温度、适量的光照及培养基适宜的pH值都是胚挽救成功的重要条件。有研究说明，常温、黑暗比低温、光照更有利于胚珠的发育[3]。
4结语
胚挽救技术作为一种高效育种技术，在无核葡萄的品种选育中得到了广泛地应用且进展迅速，不仅极大地拓宽了葡萄育种的范围和效率，更缩短了育种周期，推动了葡萄育种的进程。但是，这项技术还存在较多的不足，如虽然胚挽救技术较成熟，但葡萄无核性状的遗传规律理论研究较少；应用于远缘杂交育种，供选群体无核性状来源少且育种效率低，对不同无核葡萄的基因型还缺乏调节机制研究；对不同葡萄无核品种的适宜接种时期以及幼胚营养水平和培养条件深入研究不够；无核葡萄育种与常规有核杂交育种和分子辅助标记选择技术结合不紧密等。因此，立足已有的研究基础，胚挽救技术结合现代生物技术将会大大地提高优良无核葡萄品种的选育效果，而精确的基因定位技术和进一步完善并充分发挥无核葡萄胚挽救技术体系，是今后研究努力的方向。
5参考文献
[1] 刘三军，蒯传化，于巧丽，等.葡萄无核性状遗传与胚挽救技术的研究及应用[J].果树学报，2009，26（1）：71-76.
[2] 程和禾，吴雅琴，赵艳华.奥迪亚无核葡萄胚挽救技术研究[J].河北农业科技，2008，12（11）：30-32.
[3] 唐冬梅，蔡军社，骆强伟，等.用于无核葡萄选育的胚挽救技术研究[J].果树学报，2008，25（3）：316-321.
[4] 闫爱玲，张国军，徐海英.葡萄不同倍性品种的杂种胚挽救及鉴定[J].北方园艺，2008（7）：28-30.
[5] 李金月，王飞，王跃进.无核葡萄与有核葡萄胚挽救杂交后代的抗寒性研究[J].西北植物学，2008，17（6）：113-118.
[6] 郭印山，郭修武，张海娥.葡萄二倍体和四倍体杂交胚挽救的影响因素[J].果树学报，2006，23（1）：115-117.
[7] SCOTT K D，ALLETT E M，LEE L S.AFLP markers distinguishing an early mutant of Flame seedless grape[J].Eupytica，2000（113）：245-249.
[8] 郭海江，王跃进，张剑侠，等.葡萄抗病无核胚挽救育种及分子标记辅助选择[J].西北植物学报，2005，25（12）：2395-2401.
[9] 程琳琳，王跃进，石艳，等.无核葡萄胚挽救影响因素的研究[J].西北植物学报，2007，27（7）：1317-1322.
[10] 王飞，王跃进，周建锡.无核葡萄与中国野生葡萄杂种的胚挽救技术研究[J].园艺学报， 2006，33（5）：1079-1082.

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