中性粒细胞胞外诱捕网通过CCDC25促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用研究.pdf
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1、医学分子生物学杂志,2024,21(2):129-134 J Med Mol Biol,2024,21(2):129-134DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.02.006资助项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金(No.2021D01C335)通讯作者:颜飞华(电话:19999296677,E-mail:)This work was supported by a grant from the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region(No.2021D01C335)Correspon
2、ding author:YAN Feihua(Tel:86-19999296677,E-mail:)中性粒细胞胞外诱捕网通过 CCDC25 促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用研究木特力买买提1,徐磊磊2,李文强1,颜飞华11喀什地区第一人民医院关节骨科 新疆维吾尔自治区喀什市,8440002新疆医科大学第一附属医院骨科中心骨肿瘤外科 乌鲁木齐市,830054【摘要】目的 探究中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)在骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及其相关机制。方法纳入骨肉瘤患者和健康受试者各 20 例,通过 ELISA 检测血清中PA
3、D4 和 H3cit 水平。提取两组人群外周血中性粒细胞,比较 NETs 形成差异。将 NETs 与骨肉瘤细胞 MG63共孵育,期间加入 DNA 降解酶 DNase,分为对照组、NETs 组和 NETs+DNase组。通过蛋白质印迹检测CCDC25 蛋白表达水平,CCK8 检测细胞增殖水平,Transwell 检测细胞迁移和侵袭水平。将 si-NC 和 si-CCDC25 转染至 MG63,加入 NETs 共孵育,分为 si-NC 组和 si-CCDC25 组,通过蛋白质印迹检测 CCDC25 蛋白表达水平,CCK8 检测细胞增殖水平,Transwell 检测细胞迁移和侵袭水平。结果与健康受试
4、者比较,骨肉瘤患者血清中 PAD4 和 H3cit 水平升高(P 0.05),NETs 形成能力增强。与对照组比较,NETs 组CCDC25 蛋白表达升高,细胞增殖、迁移和侵袭水平升高(P0.05)。与 NETs 组比较,NETs+DNase组CCDC25 蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P 0.05)。与 si-NC 组比较,si-CCDC25 组CCDC25 蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P0.05)。结论 NETs 通过释放的 DNA 激活骨肉瘤细胞 CCDC25 表达,从而促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。【关键词】中性粒细胞胞外诱捕网;骨肉瘤;脱氧核糖核酸酶;卷
5、曲螺旋结构域蛋白 25【中图分类号】R738.1Role of CCDC25 Mediated Neutrophil Extracellular Traps in Promo-ting Proliferation,Migration and Invasion of Osteosarcoma CellsMuteli Maimaiti1,XU Leilei2,LI Wenqiang1,YAN Feihua11Department of Arthrology and Orthopedics,Kashgar First People s Hospital,Kashgar,XinjiangUygur A
6、utonomous Region,844000,China2Orthopedic Center Bone Tumor Surgery,the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi,830054,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the role and underlying mechanisms of neutrophil extra-cellulartraps(NETs)intheproliferation,migration,andinvasionofost
7、eosarcomacells.Methods A total of 20 osteosarcoma patients and 20 healthy subjects were enrolled.Levels ofPAD4 and H3cit in serum were measured by ELISA.Neutrophils were isolated from peripheral bloodof both groups to compare NETs formation.Co-culturing experiments were conducted by incubatingNETs w
8、ith osteosarcoma cells(MG63),with the addition of DNA degrading enzyme DNase.Thegroups included Control,NETs,and NETs+DNase groups.CCDC25 protein expression levelwas detected using Western blotting,cell proliferation was assessed using CCK-8 assay,and cellmigration and invasion were evaluated using
9、Transwell assay.MG63 cells were transfected with si-NCand si-CCDC25,then co-cultured with NETs,cells were then divided into 2 groups:si-NC and si-CCDC25 groups.CCDC25 protein expression,cell proliferation,and invasion were assessed as de-scribed above.Results Compared to healthy subjects,osteosarcom
10、a patients showed elevated lev-els of PAD4 and H3cit in serum(P 0.05),indicating enhanced NETs formation capaci-ty.Compared to the Control group,the NETs group exhibited elevated CCDC25 protein expressionlevel,increased cell proliferation and cell migration and invasion(P 0.05).The NETs+DNase group
11、showed reduced CCDC25 protein expression level,decreased cell proliferation,cell mi-gration and invasion compared to the NETs group(P 0.05).The si-CCDC25 group,when com-pared to the si-NC group,demonstrated decreased CCDC25 protein expression level,cell prolifera-tion,cell migration and invasion(P 0
12、.05).Conclusion NETs activate osteosarcoma cellCCDC25 expression through released DNA,thereby promoting tumor cell proliferation,and cell mi-gration and invasion.【Key words】neutrophil extracellular traps;osteosarcoma;deoxyribonuclease;coiled-coildomain-containing protein 25 骨肉瘤是一种主要发生在儿童和青少年阶段的恶性肿瘤,
13、约占儿童癌症的3%至5%。作为骨骼系统中最常见的原发性恶性肿瘤之一,骨肉瘤的治疗一直备受关注1-2。尽管引入新型辅助化疗方法显著提高了患者的生存率,保肢手术也逐渐成为截肢手术的替代选择,然而骨肉瘤的治疗依然具有极高的挑战性,其病死率和致残率仍居高不下3。随着对骨肉瘤认识的不断深入,研究的重点逐渐聚焦于探索新的治疗策略,尤其是针对特定的生物标志物和治疗靶点展开的治疗4-5。在这一背景下,寻找新的治疗靶点以及骨肉瘤的生物标志物成为当前研究的重要方向,这对于进一步改善骨肉瘤的治疗效果具有重要意义。中性粒细胞受刺激后形成的一种可以捕获病原微生物并引发免疫应答的特殊网状结构称为中性粒细胞 胞 外 诱 捕
14、 网(neutrophil extracellular traps,NETs)6。研究表明,在多种肿瘤组织中检测到NETs 的存在,提示 NETs 可能参与肿瘤的发生发展7-8。卷曲螺旋结构域蛋白 25(coiled-coil do-main-containing 25,CCDC25)位于人类基因组染色体 11 号的 q13.3 区域,其编码的蛋白质包含共轭螺旋结构域(coiled-coil domain),这一结构域在许多蛋白质中被广泛应用于 DNA-蛋白质相互作用和组装过程9。已有研究表明,CCDC25 能够促进胃癌细胞血管生成从而促进胃癌的恶性化10。此外,NETs 可以通过 CCDC2
15、5 加速乳腺癌和结肠癌细胞的迁移11。然而,至今尚未有关于 NETs 在骨肉瘤细胞中作用的报道,以及它是否通过 CCDC25介导其生物学功能的证据。鉴于此,本研究的主要目标是探究 NETs 和 CCDC25 在骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭过程中的作用,以期为骨肉瘤的发病机制和治疗途径寻找新的生物学标志物。1 材料和方法1.1 临床样本收集 2021 年 12 月至 2022 年 12 月期间在我院治疗的 20 例骨肉瘤患者的血清样本,并同时纳入了 20 例健康受试者的血清样本作为对照组。骨肉瘤患者的纳入标准如下:在研究期间首次来我院接受治疗的患者;年龄在30 岁及以下;经临床和影像学检查明确诊断
16、为骨肉瘤;愿意参与研究并签署知情同意书。排除标准如下:合并有其他慢性疾病(如糖尿病、慢性肾脏疾病等)或其他心血管疾病(如冠心病、高血压等)的患者;曾经接受过其他与本研究相关的治疗的患者。本研究经我院伦理委员会批准。1.2 细胞与主要仪器试剂MG63 细胞购自尚恩生物有限公司;RPMI-1640 培养基和胎牛血清购自美国 Gibco 公司;Li-pofectamineTM3000 购自美国 Invitrogen 公司;佛波醇(12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate,PMA)购自南京沃博生物公司;DNA 染料、DNase和 dsD-NA 定量试剂购自上海翌圣生物科
17、技有限公司;Tr-answell 小室购自美国 Corning 公司;CCDC25 抗体、GAPDH 抗体与 HRP 标记的二抗购自英国 abcam 公司;CCK8 试剂购自美国 sigma 公司;PAD4 和组蛋白 H3 瓜氨酸化(histone H3 citrullination,H3cit)ELISA 试剂盒购自沈阳华美生物公司;si-NC 和 si-CCDC25 委托上海生工生物工程有限公司合成。多功能酶标仪(Multiskan SkyHigh)购自美国 Thermo公司;凝胶成像仪(Tanon 2500)购自上海天能公司;荧光导致显微镜(Ts2R-FL/Ts2R)购自日本Nikon
18、公司。1.3 ELISA 法评估 PAD4 和 H3cit 水平收集两组人群外周血,2 500 r/min 离心 10min,收集上清为血清,根据 ELISA 试剂盒操作指南执行 PAD4 和 H3cit 的测定实验。首先稀释不同梯度的标准品,制备标准曲线。随后将待测样品加入抗体包被的培养板中,将板置于 37 的培养箱中,进行 30 min 的孵育。在完成孵育后,对平板进行 5 次彻底的清洗。加入 HRP 酶标二抗,再次031木特力买买提,等.中性粒细胞胞外诱捕网通过 CCDC25 促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用研究将板放入 37 的培养箱中,进行 30 min 的孵育。继续进行 5 次
19、洗板,然后将板甩干。加入 50 L 的显色液 A 和显色液 B,将板置于室温下反应 10min。最后,加入终止液以停止反应。使用酶标仪在 450 nm 波长检测吸光度值。1.4 诱导中性粒细胞形成 NETs收集两组人群的外周血样本,密度梯度离心后分离中性粒细胞,按 1 106个/孔接种于细胞培养皿中(含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基),在 37、5%CO2的细胞培养箱中培养,期间加入 PMA(100 mol/L)刺激 2 h。随后弃去上清,用 PBS 洗涤2 次。加入核酸染料,在荧光显微镜下检测 NETs 形成水平。最后用 PBS 重悬细胞沉淀,1 500r/min 离心10
20、min。收集上清液,即为 NETs。1.5 NETs 与骨肉瘤细胞共孵育和分组将 MG63 以 3 105个/孔接种于 6 孔细胞板中(含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基),于 37、5%CO2细胞培养箱中培养过夜。使用 dsDNA 定量试剂定量 NETs 含量,在 MG63 细胞中加入培养基为对照组,加入 2 g/mL NETs 为 NETs 组,加入2g/mL NETs 和 1 g/mL DNase为 NETs+DNase组。期间共孵育 24 h。1.6 敲低 CCDC25 的细胞转染和分组将 MG63 以 3 105个/孔接种于 6 孔细胞板中,于 37,5%CO2细胞培养箱
21、中培养过夜。使用LipofectamineTM2000 将合成后的 si-NC 和 si-CCDC25混合均匀,室温放置 15 min,随后分别加入至MG63 细胞中,48 h 后再加入 2 g/mL NETs 共孵育 24 h,分组为 si-NC 组和 si-CCDC25 组。1.7 蛋白质印迹检测 CCDC25 蛋白表达收集各组细胞,低温下加入 RIPA 裂解液提取总蛋白。控制每个样本量为 20 g,上样至十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)胶孔中(12%),1
22、20 V 电泳 60 min。随后将蛋白低温转移至 PVDF 膜上,250 mA 电泳 60min。脱脂奶粉封闭后加入一抗:CCDC25(1 1 000)和 GAPDH(15 000)。抗体孵育过夜,随后加入 HRP 标记的二抗(15 000)。PBST 溶液清洗 3 次后加入增强型发光液,随后在凝胶成像系统下拍照,使用 imageJ 软件对条带进行定量统计。1.8 CCK8 法检测细胞增殖水平将各组 MG63 细胞以 3 103个/孔接种于 96 孔细胞培养板中,于 37,5%CO2细胞培养箱中培养过夜。当分别培养 0、24、48 h 时,弃去旧的培养基。更换含 10%CCK8 溶液的新鲜培
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