基于高通量测序的营养不良儿童肠道菌群多样性研究.pdf
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1、175中国现代药物应用2024年1月第18卷第1期Chin J Mod Drug Appl,Jan 2024,Vol.18,No.1基于高通量测序的营养不良儿童肠道菌群多样性研究吴慧丹黄峥阳丽君江美花李扬帆梅桂斌【摘要】目的使用高通量测序模式和方法,对比分析营养不良儿童和正常儿童中肠道菌群物种存在的多样性和实际组成特点存在的差异。方法选取 20 例营养不良患儿作为 A 组,选择 20 例身体正常的儿童作为 B 组,采集分析粪便样本,提取细菌中的核糖体 DNA(RDNA),通过两组聚合酶链式反应(PCR)模式和方法,增加 V4V5 区域实现高通量的测序设计,并进行生物信息学的分析研究;构建相应的
2、稀释曲线,使用 MOTHUR 软件实现 APLHA 的多样化的计算分析,通过 R 语言实现热图(HEAT MAP)分析研究,实现典型关联分析(CCA),之后分别在样本的门和属两个列表中实现数据的整合和归纳,进行统计分析。结果两组年龄、性别、分娩方式等一般资料比较,差异无统计学意义(P0.05)。两组生物多样性比较差异无统计学意义(P0.05)。两组生物多样性比较差异无统计学意义(P0.05)。两组样本中共发现微生物 154 种。A 组肠道菌群的操作性分类单元(OTU)为 320,B 组大肠产甲烷菌群的 OTU 为 348,以及其共同 OTU 为 290,两组肠细菌群门的细菌中共检出 14 个。
3、为更好地展现检测结果,本研究依托柱状图优势,将各个样品进行分类学层面的比较和研究。A 组硬壁菌门及未分级菌(乳酸菌)的 OTU 少于 B 组,拟杆菌(多形状杆菌、罗斯菌)的 OTU 多于 B 组,差异有统计学意义(P0.05),其他菌群丰度比较差异有统计学意义(P0.05).There was no statistically significant difference in biodiversity between the two groups(P0.05).A total of 154 microbial species were found in the two groups of s
4、amples.The operational taxonomic unit(OTU)of intestinal flora of group A was 320,the OTU of group B colorectal methanogens was 348,and their common OTU was 290.A total of 14 species of intestinal flora were detected in the two groups of children.In order to better display the test results,this study
5、 relied on the advantages of bar charts to compare and study each sample at the taxonomic level.OTU of Firmicutes and ungraded bacteria(lactic acid bacteria)in group A was less than that in group B,and OTU of Bacteroides 基金项目:福建省卫生健康科技计划项目(项目编号:2021QNA034)作者单位:350012福建省疾病预防控制中心食品营养研究室实验研究176中国现代药物应用
6、2024年1月第18卷第1期Chin J Mod Drug Appl,Jan 2024,Vol.18,No.1营养不足是当各种营养素由于摄食过度或摄入量不够或消化吸收障碍等各种因素引起产生的某种营养素失调症状1。营养不足是一种全球性的普遍性问题,在欧盟和美洲等发达国家以超重为主,非洲及东南亚等发达国家以身材矮小及生长发育迟缓为主,而南亚和东非等区域主要为出现 5 岁内的低体重儿,其中有多达 33%的儿童发生营养素不足和肠道的通透性显著提高,出现腹泻及吸收障碍等一系列问题,导致儿童的生长发育减缓2。就目前来说,营养素干预及相应的饮食调整方法无法切实可行的治疗营养不良对身体正常生长、发育产生阻碍作
7、用,提升疾病发生几率。近期研究成果表明,微生物群落作为人类第二基因组,在很多层面影响了人类健康水平3。以肠道菌群为例,其共生在肠道中,能够提取食物中的营养物质,增强食物消化和吸收能力,尤其对肠道功能尚不健全的儿童来说,肠道菌群的完整性和丰富性,对其生长发育有着最为直接的影响。结合以往经验,人体内的肠道菌群结构组成和数量分布总体上处于动态平衡的状态,如果倡导微生态的平衡出现一定程度的紊乱,出现菌群失调等问题,对人体肠道运动能力、营养吸收能力和能量换化能力产生消极影响4。本文就主要使用高通量测序方法和模式,对比研究营养不良患儿和正常儿童中肠道菌群物种的多样性及差异情况,分析儿童营养不良和肠道微生物
8、群落的具体联系性。1资料与方法1.1一般资料本研究选择 2022 年 16 月在本院门诊就诊中出现营养不良的患儿共 20 例作为 A 组,其中男 8 例,女 12 例。纳入标准:由于喂养不当、饮食搭配不合理等原因出现营养不良的情况,如挑食、偏食及没有科学的喂食方法等;排除标准:近半年出现传染性腹泻及抗生素应用。选取20例健康儿童视为B组,其中男 9 例,女 11 例。1.2诊断标准按照国际通用标准判定儿童营养不足有关情况,并在此基础上开展有效估测和预算。根据患儿体重判定。根据同年龄段孩子的体重标准作为参考,如果较正常体重低 15%25%之间,属于轻度营养不良;较正常体重低 26%40%则为中度
9、(Bacteroides thetaiotaomicron and Rothia)was more than that in group B.The difference was statistically significant(P0.05).The abundance of other bacterial communities showed statistical significance(P0.05).Conclusion The number of Firmicutes in the intestinal flora of malnourished children is low,a
10、nd the content of Bacteroides thetaiotaomicron and Rothia is high.Therefore,in order to ensure the stability and balance of the flora,it is necessary to adjust the colony by taking advantage of the actual characteristics of different bacteria genera to ensure that children have good absorption and p
11、hysical development.【Key words】High-throughput sequencing;Malnutrition;Childrens intestines;Diversity of flora营养不良;较正常体重低 40%以上为重度营养不良5。根据皮下脂肪厚度情况判定:腹壁皮下脂肪厚度为0.40.8 cm为轻度营养不良,腹壁皮下脂肪厚度0.4 cm 为中度营养不良,全身皮下脂肪几乎消失为重度营养不良6。1.3方法1.3.1样本采集研究过程中严格按照规定的采样流程,使用采集盒开展采集工作。为防范样本污染情况,采集环节应当科学运用采集勺,采集重量为 5 g 左右的粪便,
12、并放入到具有保存液的保存管中,并马上转入到-80的环境保存7。1.3.2DNA 的提取和测序采集和使用 QLAAMP 试剂盒进行粪便样本的抽取提炼,使用浓度为 12%的琼脂凝胶进行抽取,得到基因组的 DNA,通过 PCR 的模式实现文档构建,利用 525 和 926 引物进行扩增,之后使用相关检测平台,将接头、测序引物和其他标签列加入到两端位置,使用美国 AXYGEN 公司生产的凝胶回收试剂盒进行回收,使用实时荧光定量 PCR 仪 FTC-3000 技术进行荧光的定量分析,在均一化混合完成后通过文库进行构建研究,使用 ILLUMIAN 进行文库的测序。1.3.3稀释性曲线对研究过程中获得的系列
13、数据,借助 TRIMMOMATIC 软件对低质量序列进行去除,对去除后的序列使用 FLASH 软件开展序列的二次拼接,在此基础上,借助 MOTHUR 对序列开展质量控制,从而获得最优化的序列8。从实际效果来看,MOTHUR软件对数据的处理可以有效排除冗余数据、干扰数据的影响,形成最具代表性的 OTU 稀释性曲线,以更加真实地反映出质量系列变化情况,最大程度地保证测序数据的丰富程度,为后续研究工作高质量开展提供便利9。如果曲线最终达到平稳后表明测序科学合理,对优化的序列通过 97%的相似性进行对比分析,并进行相应的信息标注处理。1.3.4多样性分析本研究借助 MOTHUR 软件,对ALOHA 开
14、展多样性分析和计算,从最终研究获得的ALPHA 指标中,评估分析 CHAO 和 ACE 的指数变化情况10。结合过往经验,CHAO 和 ACE 指数越大,表177中国现代药物应用2024年1月第18卷第1期Chin J Mod Drug Appl,Jan 2024,Vol.18,No.1明 SIMPSON 实际数值越小,检测样本中的微生物种类越多、类型越丰富。使用 R 语言进行分析,箱线图实现展示样品组中存在的多样化分布,实现数据的分布情况,具体差异使用 P 值进行表示,箱体中也就证明该组数据中50%的分布区间和中间线都确定为中位数,如果范围 1.5 箱体则为最大值或最小值11。1.4统计学方
15、法采用 SPSS20.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数 标准差(x-s)表示,采用 t 检验;计数资料以率(%)表示,采用2、q、w 检验或 Fisher 确切概率法。P0.05),具有可比性。见表 1。2.2两组物种丰度及生物多样性分析两组粪便中共得到1394074个有效序列,优化序列数量为1268032个,平均长度 410。通过对上述序列分析,实现序列数当代表的 OTU 进行稀释性的结构曲线分析,可见大部分样本呈平坦趋势达到饱和,但部分样本曲线没有达到平坦,证明两组微生物种类都较为丰度。通过箱线图像进行显示,两组生物多样性比较差异无统计学意义(P0.05)。证明两组肠道
16、菌群的丰度和均匀度无显著差异。见图 1。表 1两组一般资料比较n,x-s,n(%)组别例数性别平均月龄(个月)剖宫产早产儿母乳喂养男女A 组2081218154(20)3(15)4(20)B 组2091122122(10)2(10)2(10)2/t0.1020.9310.7840.2290.784P0.7490.3580.3760.6330.376注:两组比较,P0.05图 1OTU 水平系数曲线和 Shannon 指数图序列数OTU 数值序列数Shannon 多样性Shannon 指数图曲线多样本稀释曲线2.3两组肠道菌群物种分析两组样本中共发现微生物 154 种。A 组肠道菌群的 OTU
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