Cullin7在胃癌中的表达及相关性分析.pdf

基金项目:江苏省基础研究计划(自然科学基金)青年基金项目(.)作者简介:刘业锋男副主任医师研究方向:普外及全科医学的常见病多发病的诊治:.通信作者:王星男博士讲师研究方向:代谢性疾病药理与中药药理:.在胃癌中的表达及相关性分析刘业锋李飞谢伟王星(.句容市人民医院普外科江苏 句容.中国药科大学药学院药理系江苏 南京)摘要:目的 探讨泛素连接酶 蛋白抗体()在胃癌中的表达及其对胃癌发生发展的作用 方法自癌症基因组图谱()数据库下载胃癌患者 水平数据并进行生存状况分析并收集了 例接受手术治疗胃癌患者的胃癌和癌旁组织样本免疫组化分析 的表达水平并评估 表达水平与胃癌患者临床病理特征之间的相关性同时通过在人胃癌 细胞系中过表达或敲除 基因利用四甲基偶氮唑盐()、集落形成、划痕、迁移和 侵袭实验研究 对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 结果 在胃癌组织中高表达且 高表达的患者总生存期、首次进展和进展后生存时间更短同时 的表达与胃癌患者分化程度、神经侵袭、血管侵袭、浸润深度、淋巴结转移、临床分期相关差异有统计学意义而 在胃癌细胞中的过表达促进细胞增殖、迁移和侵袭而用短发夹()敲低 可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭差异有统计学意义 结论 的上调可能是促进胃癌发生和发展的重要因素可作为胃癌诊断、预后新的生物标志物以及新的治疗靶点关键词:胃癌泛素连接酶 蛋白抗体预后临床病理特征增殖迁移侵袭中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.(.):.().()().().药学研究 .:胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一发病率逐年上升其中东亚地区占一半胃癌初期症状隐匿和诊断较晚是胃癌高死亡率的最主要原因 目前胃癌的最佳治疗方法是手术切除辅以辅助化疗或放疗 然而胃癌的复发率仍然很高胃癌患者的预后较差且胃癌晚期患者的临床疗效仍然较差 因此胃癌发生、增殖和转移的内在分子机制值得进一步研究以期改善临床治疗效果泛素连接酶 蛋白抗体()基因是 连接酶家族的成员参与蛋白质泛素化以供进一步的蛋白酶体降解控制正常发育、初级细胞过程等且研究表明 的过度表达与肿瘤的发生密切相关 等研究表明 在肝癌组织中高表达尤其是在转移性肝癌组织中能显著促进肝癌细胞增殖、生长、迁移和侵袭且 可增强人类表皮生长因子受体()阳性乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗的抵抗力 同时 在胶质瘤细胞中过表达并通过激活核转录因子 ()促进肿瘤发生 但是在胃癌中的作用尚不清楚 因此 我们研究 了 在胃癌中的表达及对胃癌发生发展的作用为寻找胃癌新的治疗靶点提供依据 材料与方法.患者及临床样本、细胞和抗体 石蜡包埋组织切片取自 年 月至 年 月在句容人民医院存档的胃癌样本和匹配的相邻正常组织标本()手术切除前无患者接受放疗或化疗 肿瘤组织标本取自肿瘤边界从距离肿瘤边缘 以上的正常胃组织中取癌旁胃组织样本并作为对照所有标本的组织病理学诊断均由两名训练有素的病理学家确认 研究经医院伦理委员会审查批准(伦理委员会批准证书编号:)纳入标准:所有患者均接受手术治疗符合胃癌诊断标准首次诊断并治疗胃癌术前未接受新辅助放化疗等治疗措施既往无癌症病史无较严重的基础医学疾病等患者或其家属应了解自己的义务和权利并签署同意书排除标准:伴有胃溃疡、慢性萎缩性胃炎、间质瘤等良性疾病的患者拒绝参加的病理资料缺失或不完整合并其他系统性肿瘤人胃癌细胞株 购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库、及相应的二抗均购自 公司 培养基、胎牛血清购自 公司 试剂、一步法反转录荧光定量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司 购自 小室购自 公司四甲基偶氮唑盐()试剂盒购自碧云天生物技术公司.免疫组织化学检测手术切除标本用福尔马林固定乙醇系列脱水二甲苯处理石蜡固定 厚的组织切片脱蜡再水化用 过氧化氢在甲醇中孵育 随后用 .高温高压修复法回收抗原 孵育切片 载玻片用兔抗人多克隆抗体(稀释)在 孵育过夜阴性对照为正常非免疫兔血清二抗室温孵育 后用链霉亲和素过氧化物酶复合物孵育载玻片用 二氨基联苯胺进行过氧化物酶反应用苏木精反染色切片脱水透明盖上盖片用中性胶密封 肿瘤和正常组织标本由两名独立的病理学家进行评估 的表达主要集中在细胞核内如果肿瘤组织或正常组织中检测到 以上的细胞表达则认为切片呈阳性.实验 用蛋白裂解缓冲液裂解细胞离心提取十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳()分离蛋白然后转移至聚偏二氟乙烯()膜脱脂奶粉室温封闭 一抗 和 过夜孵育后用含 的磷酸盐缓冲液()洗涤 次 二抗室温孵育 洗涤 次后通过增强的化学发光检测试剂检测结合的抗体 采用 软件用于分析条带的灰度值.质粒构建和稳定转染 细胞系的建立按照文献方法 过表达质粒.()由 公司合成特异性短发夹()由上海吉凯基因医学科技股份有限公司设计合成 根据说明书用 分别将 空载质粒或 过表达质粒和空载 或 分别导入 细胞用嘌呤霉素筛选 周药学研究 .后获得稳定的转染细胞系.实时荧光定量 ()采用 试剂提取 并应用 一步法反转录荧光定量试剂盒进行 作为加载对照重复 次引物序列如下:(正义引物:反义引物:)(正义引物:反义引物:).检测方法 转染、后加入 的 孵育 去除旧培养基后加入二甲基亚砜 培养 测定波长为 参比波长为 每组重复 个孔.集落形成实验细胞以每皿 个细胞的密度接种在 长的培养皿中 培养 周后将细胞固定结晶紫染色根据每个克隆内的细胞数计数可见集落 所有实验都重复 次 用形成的集落数除以所培养的细胞总数来确定细胞的培养效率.细胞划痕实验 将各组细胞以每孔 个的密度接种在具有完全培养基的 孔板中当细胞融合度达到 时使用无菌塑料吸管尖端创建单个划痕然后用 轻轻清洗两次更换完整的培养基 在 和 用倒置显微镜拍摄细胞迁移情况并测量创面宽度.细胞侵袭和迁移实验使用 涂层的 小室进行细胞侵袭实验该小室包含 孔的聚碳酸酯过滤器且涂有 基质 将 无血清培养基中的细胞()接种于上室而将 含胎牛血清的培养基加入下室 孵育 后将迁移到膜下表面的细胞固定在 多聚甲醛中并用.结晶紫染色对于每个膜在 倍放大倍数下计算 个随机视野 细胞迁移实验类似于侵袭实验只是 小室未涂有.统计分析所有统计分析均使用 .软件进行 使用 方法分析生存曲线使用 检验比较生存差异数据从 数据集中下载计量资料以平均值()标准差()表示采用 检验进行差异比较计数资料表示为例数和百分率()采用检验进行差异比较.表示差异具有统计学意义 结果.在胃癌组织中的表达并与不良预后的相关性 为了探讨 在胃癌进展中的作用首先研究了 在胃癌组织中的表达 如表 所示肿瘤组织中 表达高于癌旁组织(.)并且通过分析 数据集中胃癌组织和正常胃上皮组织的基因表达谱 在胃癌组织中也上调(.见图)生存分析显示(数据从 数据集下载)与 表达低的患者相比 高表达的患者总生存期、首次进展和进展后生存时间更短(.)(见图 )差异有统计学意义 这些结果表明 在胃癌组织中上调并且与不良预后呈正相关图 在胃癌组织中的表达及与不良预后的相关性 注:与正常组织比较 .表 蛋白在胃癌组织中的表达组别例数阴性()阳性()胃癌组织癌旁组织.表达上调与胃癌晚期临床病理特征的相关性 如表 所示 的表达与分化程度(.)、神经侵袭(.)、血管侵袭(.)、浸润深度(.)、淋巴结转移(.)、临床分期(.)相关但与性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小无关.过表达 基因与胃癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的相关性采用 细胞建立稳定过表达 蛋白的细胞系如图 和 药学研究 .所示 和 均证实了转染率与空白组细胞相比转染了 表达载体的 细胞在蛋白(.)和 (.)水平上均上调 且如图 和 所示与空白组细胞相比过表达 的细胞增殖能力增加(.)和 (.)增殖能力高于空白组且产生了更多更大的细胞集落(.)如图 所示孵育 后过表达 的细胞横向移动能力高于空白组(.)且如图 所示与空白组细胞相比过表达 的细胞迁移(.)和侵袭(.)能力提高.敲减 基因与胃癌细胞体外增殖、迁移和侵袭能力的相关性采用 在 细胞系中产生了稳定的 基因敲减如图 和 所示 和 均证实了转染率与空白组细胞相比转染了 的 细胞在蛋白(.)和 (.)水平上均降低 且如图 和 所示 基因敲减抑制了 细胞的生长敲减 基因的细胞在 (.)和 (.)的增殖能力低于空白组且集落数低于空白组(.)同时如图 所示孵育 后敲减 基因的细胞横向移动能力低于空白组(.)且如图 所示与空白组细胞相比敲减 基因降低了 细胞的迁移(.)和侵袭(.)能力表 与胃癌患者临床病理特征的关系临床病理特征例数阴性()阳性()性别男(.)(.)女(.)(.).年龄(岁)(.)(.)(.)(.).肿瘤位置胃食管连接部(.)(.)胃体(.)(.)胃窦幽门部(.)(.).分化程度高(.)(.)中(.)(.)低(.)(.).神经侵袭有(.)(.)无(.)(.).血管侵袭有(.)(.)无(.)(.).肿瘤大小(.)(.)(.)(.).浸润深度(.)(.)(.)(.).淋巴结转移有(.)(.)无(.)(.).临床分期(.)(.)(.)(.).图 过表达对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响()注:与空白组比较.与 比较.药学研究 .图 敲减 基因对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响()注:与空白组比较.与 比较.讨论胃癌的高发病率和高死亡率已成为威胁人类健康的公共卫生问题 然而胃癌是一种异质性疾病发病机制复杂 涉及遗传、饮食、地域等多种因素 在胃癌发生过程中患者早期症状不明显同时许多胃癌患者在手术切除原发性肿瘤后仍会发生转移转移仍然是胃癌有效治疗的主要障碍迫切需要确定导致胃癌增殖、侵袭和转移的新机制蛋白质泛素化是一种翻译后修饰过程在基因转录、细胞周期转换、复制及修复、信号转导和病毒感染等各种生物过程中起着重要作用作为组织 泛素连接酶的分子支架 参与蛋白质泛素化过程比如 连接酶的底物识别亚基 介导细胞周期蛋白 的泛素化和细胞周期进程 研究表明 通过调控生长、分化和细胞凋亡的通路促进肿瘤进展 的过表达与癌症的发生和发展有关 促进癌细胞的上皮 间质转化并促进肝癌的转移 且 在人类肺癌中表达增加并且敲低 表达抑制肺癌细胞增殖 在本研究中 在胃癌组织和癌旁组织中存在差异同时通过分析 数据集中胃癌组织和正常胃上皮组织的基因表达谱 在胃癌组织中也上调差异有统计学意义且生存分析显示 水平高的患者总生存期、首次进展和进展后生存时间更短而在大多数胃癌样本中观察到 的过度表达其核积累随着肿瘤分化程度的降低而增加且与胃癌、神经侵袭、血管侵袭、浸润深度、淋巴结转移和临床分期密切相关表明 在胃癌中具有临床相关性为了研究 表达对胃癌增殖、迁移和侵袭的影响在人胃癌 细胞系中通过异位过表达或 检测 功能的获得或丧失 来自、集落形成、划痕实验、迁移和 侵袭测定的数据表明 在胃癌细胞中的异位表达促进细胞增殖、迁移和侵袭而用 敲低 表达可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭差异有统计学意义 因此 可能对胃癌细胞的增殖、存活、迁移和肿瘤发生至关重要总之本研究表明 的上调可能是促进胃癌发生和发展的重要因素可作为胃癌诊断、预后新的生物标志物以及新的治疗靶点参考文献:./.药学研究 .():.:.():.():./.():.().():.国家卫生健康委员会.胃癌诊疗规范(年版).中华消化病与影像杂志(电子版)():.():.():.().():.():.王芳包迪.在肺癌组织中的表达及临床意义.临床肺科杂志():.(收稿日期:)药学研究关于抵制学术不端行为的声明捏造与篡改数据、抄袭剽窃、重复发表、虚假署名、一稿多投等学术不端行为不仅违反学术规范和道德同时也有悖于国家相关法律法规在学术界乃至社会造成恶劣影响 为加强科技道德规范促进科研诚信本刊编辑部严格遵守中华人民共和国著作权法等相关法律法规坚决反对学术不端行为 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