HDAC3抑制剂RGFP966通过下调TGF-β1_SMAD3_STAT-1信号通路抑制AIM2炎症小体活化和EMT缓解子宫内膜纤维化.pdf
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1、医学分子生物学杂志,2024,21(3):211-216 J Med Mol Biol,2024,21(3):211-216DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.03.004资助项目:中央引导地方科技发展资金(No.2022ZY0186)通讯作者:卢建军(电话:13947104888,E-mail:)This work was supported by a grand from the Central Guidance on Local Science and Technology Development Fund(No.2022ZY0186)Correspond
2、ing author:LU Jianjun(Tel:86-13947104888,E-mail:)HDAC3 抑制剂 RGFP966 通过下调 TGF-1/SMAD3/STAT-1 信号通路抑制 AIM2 炎症小体活化和 EMT 缓解子宫内膜纤维化卢建军,张新悦内蒙古医科大学附属医院妇产科 呼和浩特市,010059【摘要】目的 探讨 HDAC3 抑制剂 RGFP966 缓解子宫内膜纤维化的分子机制。方法 将18 只6 8 周雌性 SD 大鼠随机分为 3 组,Control 组、IUA 模型组(即宫内粘连大鼠模型组)、RGFP966 治疗组(IUA 模型组给予 HDAC3 抑制剂 RGFP966
3、 治疗),每组 6 只。建立 IUA 大鼠模型。ELISA 测定大鼠血清炎症因子TNF-、IL-1 和 IL-6 水平。qPCR 法测定大鼠子宫内膜组织上皮间质转化标志物 E-cadherin、N-cadherin、-SMA、Vimentin mRNA 相对表达水平。蛋白质印迹法测定大鼠子宫内膜组织 TGF-1、SMAD3、p-STAT-1、STAT-1、AIM2、IL-18、cleaved-IL-1、IL-1 的表达水平。结果与 Control 组相比,IUA 模型组大鼠子宫角壁变薄,血清炎症因子 TNF-、IL-1、IL-6 水平升高(P0.05);E-cadherin mRNA 相对表达
4、水平降低,N-cadherin、-SMA、Vimentin mRNA 相对表达水平升高(P0.05);TGF-1、SMAD3、p-STAT-1 蛋白质表达水平增强(P 0.05);AIM2、IL-18、cleaved-IL-1 的表达水平增强(P 0.05)。与 IUA 模型组相比,RGFP966 治疗组部分逆转(P 0.05)。结论HDAC3 的抑制剂 RGFP966 可通过下调 TGF-1/SMAD3/STAT-1 信号通路抑制AIM2 炎症小体和 EMT,缓解子宫内膜纤维化。【关键词】子宫内膜纤维化;宫内粘连;HDAC3 抑制剂 RGFP966;TGF-1/SMAD3/STAT-1 信号
5、通路;AIM2 炎症小体【中图分类号】R711;R-332HDAC3 Inhibitor RGFP966 Alleviates Endometrial Fibrosis by Regu-lation of AIM2 Inflammasome and EMT through TGF-1/SMAD3/STAT-1 Signaling PathwayLU Jianjun,ZHANG XinyueDepartment of Obstetrics and Gynaecology,Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital,Hohhot,01
6、0059,China【Abstract】Objective To investigate the molecular mechanisms of HDAC3 inhibitor RGFP966in alleviating endometrial fibrosis.Methods A total of 18 female SD rats(6-8 weeks)were ran-domly divided into 3 groups:Control group,IUA Model group(intrauterine adhesion rat Model),and RGFP966 Treatment
7、 group(IUA model group rats were treated with HDAC3 inhibitorRGFP966),with 6 rats in each group.IUA rat model was established.ELISA was used to determine thelevels of the serum inflammatory cytokines TNF-,IL-1 and IL-6.qPCR was used to determine the rel-ative mRNA expression levels of EMT markers E-
8、cadherin,N-cadherin,-SMA and Vimentin.Westernblotting was used to determine the protein expression levels of TGF-1,SMAD3,phosphorylated STAT-1,STAT-1,AIM2,IL-18,cleaved IL-1 and IL-1.Results The walls of uterine horn in the IUAModel group were thinner,the levels of serum inflammatory cytokines TNF-,
9、IL-1 and IL-6 were in-creased when compared with those in the Control group(P0.05).The relative expression levels of E-cadherin mRNA were decreased,while the relative expression levels of N-cadherin,-SMA and Vimen-tin mRNA were increased(P0.05).The expression levels of TGF-1,SMAD3,p-STAT-1 were en-h
10、anced(P0.05).And the expression levels of AIM2,IL-18,cleaved IL-1 were increased(P 0.05).The above indicators were partially reversed in RGFP966 Treatment group when compared withthose in the IUA Model group(P0.05).Conclusion HDAC3 inhibitor RGFP966 canalleviate endometrial fibrosis by down-regulati
11、ng TGF-1/SMAD3/STAT-1 signaling pathway to inhibitAIM2 inflammasome activation and EMT.【Key words】endometrial fibrosis;intrauterine adhesion;HDAC3 inhibitor RGFP966;TGF-1/SMAD3/STAT-1 signaling pathway;AIM2 inflammasome 宫内粘连(intrauterine adhesion,IUA)严重时被称为阿什曼综合征(Ashermans syndrome),指由感染或外伤等引起的子宫内膜损
12、伤。IUA 可引起子宫腔和/或子宫颈因纤维粘连而完全或部分闭合,导致生殖功能严重受损,如月经紊乱、闭经、继发性不孕或反复流产等1-2。部分成功妊娠的IUA 患者甚至可能出现胎盘粘连、胎盘着床、早产等症状3。由于大部分 IUA 患者缺乏症状或症状不典型,其真实的发病率和确切患病率通常被低估。一般情况下,IUA 发生在 6%24%的接受宫腔镜子宫成形术的妇女中,10%20%的人工流产时接受扩宫和刮宫(postpartum dilation and cu-rettage,D&C)手术的妇女中,20%30%的接受超过两次的产后 D&C 的妇女中,以及20%30%的在产后第 2 4 周需要使用子宫内固定
13、器械的妇女中4。IUA 的发病机制尚无定论,目前存在多种假说,包括子宫腔微环境促纤维化增生理论、干细胞分化异常理论、成纤维细胞诱导炎症反应等理论5-6。其中,纤维化增生理论是研究最广泛,也是支持证据最多的假说。而且 IUA 的病理特征也属于子宫内膜纤维化7。在临床 IUA 样本中可检测到多种异常高表达的纤维化标志物,包括雌激素受体、基质衍生因子-1(stromal derived factor-1,SDF-1)和转化生长因子-1(transforming growthfactor-1,TGF-1)等8-9。组蛋白去乙酰化酶 3(histone deacetylase 3,HDAC3)是一种重要
14、的表观遗传学调节因子,在多种脏器的纤维化疾病进展中发挥促进作用。如HDAC3 激活 NOTCH1/STAT1 信号上调炎症小体促进肺纤维化10。TGF-1/SMAD3 通过抑制 HDAC3抑制心肌梗死后的心肌纤维化11。在该研究中拟通过使用 HDAC3 抑制剂 RGFP966 处理 IUA 模型大鼠,探讨其缓解子宫内膜纤维化的分子机制。1 材料与方法1.1 实验材料18 只 6 8 周雌性 Sprague-Dawley(SD)大鼠(体质量 230 280 g)购自内蒙古医科大学实验动物中心。抗大鼠血清 TNF-(货号 ml002953),IL-1(货号 ml037373)和 IL-6(货号 m
15、l064292)ELISA 试 剂 盒 购 自 上 海 酶 联 生 物(中 国)。EasyPure RNA Purification Kit(货号 ER701-01),EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Syn-thesis SuperMix(货号 AE311-02),TransStart GreenqPCR SuperMix(货号 AQ101-01)购自北京全式金生物(中国)。兔抗大鼠 TGF-1 单抗(货号 MA5-15065),SMAD3 单抗(货号 MA5-14939),磷酸化(p)-STAT-1 多抗(货号 44-376 G),STAT
16、-1 单抗(货号 MA1-037),AIM2 多抗(货号 14-6008-93),IL-18 多抗(货号 PA5-79479)、cleaved-IL-1 单抗(货号 PA5-105048),IL-1 多抗(货号 P420 B),GAPDH 单抗(货号 MA1-16757);IgG(H+L)二抗(货号 31460)购自 Thermo Fisher(美国)。1.2 方法1.2.1 实验动物 18 只 6 8 周雌性 SD 大鼠饲养于恒温 (23 2)、恒湿(50%70%)、配备 12 h/12 h 光照/黑暗循环的标准 SPF 级鼠房。大鼠饲喂标准啮齿类动物饲料,每 4 只大鼠一个鼠笼。大鼠可以自
17、由采食和饮水。对大鼠实施建模手术前,先适应性饲养一周。所有动物实验均经我院伦理委员会批准。1.2.2建立宫内粘连大鼠模型为了建立宫内粘连(intrauterine adhesion,IUA)大鼠模型,对大鼠行腹腔注射 10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉,麻醉后的大鼠可自主呼吸。大鼠仰卧位,剔除其下腹部毛发,并用 70%乙醇进行皮肤表面消毒。在大鼠下腹部行纵向切口(约 3 cm),暴露双侧子宫角。用夹子将子宫角与子宫下段峡部连接处闭合。然后用 1 mL 注射器将约 0.5 mL 95%乙醇注入子宫角腔内处理 5 min。结束后用生理盐水彻底冲洗子宫腔和腹腔。然后缝合大鼠腹部,将其放回鼠笼恢复1
18、2。手术后第 9 天,采用 CO2窒息法安乐死大鼠。采集其血样和双侧子宫角充血处组织,一侧子宫角充血处组织立即置于-80 冰箱,备用;另一侧子宫角充血处组织浸没入 10%福尔马林中,4 212卢建军,等.HDAC3 抑制剂RGFP966 通过下调TGF-1/SMAD3/STAT-1 信号通路抑制AIM2 炎症小体活化和EMT 缓解子宫内膜纤维化下固定超过48 h,然后制备石蜡组织切片,备用。1.2.3 实验动物分组和处理方式 18 只大鼠随机分为 3 组,每组 6 只:Control 组,不做任何处理;IUA 模型组,大鼠接受 IUA 建模手术;RGFP966 治疗组,大鼠接受 IUA 建模手
19、术后立即行腹腔注射 RGFP966(10 mg/kg),然后 2 次/d,连续治疗至大鼠被安乐死。1.2.4 ELISA 使用商业化成品抗大鼠血清 TNF-、IL-1 和 IL-6 ELISA 试剂盒进行测定,具体实验测定方法按照试剂盒说明书中的指导进行即可。1.2.5 qPCR 向每 mg 大鼠子宫内膜组织中加入1 mL Trizol 裂解液,在液氮中制备组织匀浆。使用EasyPure RNA Purification Kit 提取总 RNA。使用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Syn-thesis SuperMix 反转录合成 cDNA。
20、使用 TransStartGreen qPCR SuperMix 进行 qPCR 扩增。qPCR 反应扩增程序为:95(2 min);94(30 s),60 (30 s),此步骤采集荧光信号,循环 40 次。qPCR 特异性引物见表 1。表 1 qPCR 特异性引物表引物名称 引物序列(5-3)E-cadherin FPCTGCCGTCCCGGCTTCAGE-cadherin RPGATGCCGTTTGACTGTGATN-cadherin FPGGCGAGGACGTCCAGGGAAN-cadherin RPGTGTGCGGGCCGCAGCGCAG-SMA FPCTCTCCACCTGCAAGAC
21、CATC-SMA RPGCCACCCGGTCGCGGGTGCTGVimentin FPCACCCGCACCAACGAGAAGGVimentin RPCTCCCTCATCTCCTCCTCGAPDH FPGCAAGTTCAACGGCACAGTCGAPDH RPGGTGAGCCCCAGCCTTCTCC1.2.6 蛋白质印迹向每 mg 大鼠子宫内膜组织中加入 1 mL 补充有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物的 RIPA 裂解液,在液氮中制备组织匀浆。随后按照常规方法进行 SDS-PAGE 凝胶电泳和半干转印法电转印总蛋白质至 PVDF 膜上。使用 5%脱脂奶粉对膜进行封闭,室温 1 h。向膜上滴加一抗
22、工作液,在4 中共同孵育过夜;次日向膜上滴加二抗工作液,室温共同孵育 1 h。使用 ECL 超敏化学发光底物对目的条带进行显影。抗体工作液稀释度如下:TGF-1(1 2 000 稀释),SMAD3(11 500稀释),磷酸化(p)-STAT-1(1 1 500 稀释),STAT-1(11 500 稀释),AIM2(11 500 稀释),IL-18(1 1 000 稀释)、cleaved-IL-1(11 500稀 释),IL-1(1 2 000 稀 释),GAPDH(12 000稀释);IgG(H+L)二抗(1 6 000 稀释)。1.2.7 统计学分析计量数据表示为平均值 标准差(x s)的形
23、式。使用 GraphPad Prism v8.0软件进行统计学分析。3 组间差异性比较,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和 Bonfferoni 多重比较。P0.05 认为差异具有统计学意义。2 结果2.1 HDAC3 抑制剂 RGFP966 下调 IUA 模型大鼠血清炎症因子水平 与 Control 组相比,IUA 模型组大鼠子宫角壁变薄(P 0.05);与 IUA 模型组相比,RGFP966治疗组大鼠子宫角壁变厚(P0.05)(表 2)。与Control 组相比,IUA 模型组大鼠血清炎症因子 TNF-(图1A)、IL-1(图1B)、IL-6(图1C)水平升高(P0.05)
24、;与 IUA 模型组相比,RGFP966 治疗组大鼠血清上述炎症因子水平降低(P0.05)。表 2 大鼠子宫角壁厚度测定分组子宫角壁厚度(m)Control 组677.5 33.8IUA 模型组213.2 15.6RGFP966 治疗组489.4 23.6#P0.05F505.3注:与 Control 组相比较,P 0.05;与 IUA 模型组相比较,#P0.05。A C:大鼠血清炎症因子 TNF-(A)、IL-1(B)、IL-6(C)水平测定统计结果柱状图。1:Control 组;2:IUA 模型组;3:RGFP966 治疗组。P0.05。图 1 大鼠血清炎症因子水平测定312医学分子生物学
25、杂志,2024,21(3):211-216 J Med Mol Biol,2024,21(3):211-2162.2 HDAC3 抑制剂 RGFP966 下调 IUA 模型大鼠子宫内膜组织 EMT 水平 与 Control 组相比,IUA 模型组大鼠子宫内膜组织 EMT 标志物 E-cadherin mRNA 相对表达水平降低,N-cadherin、-SMA、Vimentin mRNA 相对表达水平升高(P 0.05);与 IUA 模型组相比,RGFP966 治疗组大鼠子宫内膜组织 EMT 标志物 E-cadherin mRNA 相对表达水平升高,N-cadherin、-SMA、Vimenti
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