阻断PI3K_AKT_mTOR信号对白血病HL-60细胞的影响.pdf
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1、医学分子生物学杂志,2024,21(3):254-258 J Med Mol Biol,2024,21(3):254-258DOI:10.3870/j.issn.1672-8009.2024.03.010资助项目:湖北省卫生健康委联合基金(No.WJ2019H475)通讯作者:汤晶(电话:15172003516,E-mail:)This work was supported by a grant from the Hubei Provincial Health Commission Joint Fund Project(No.WJ2019H475)Corresponding author:TA
2、NG Jing(Tel:86-15172003516,E-mail:)阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号对白血病 HL-60 细胞的影响郭琛,汤晶黄石市第二医院检验科,黄石市临床检验技术重点实验室 湖北省黄石市,435000【摘要】目的 探讨阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号对白血病细胞的影响。方法选取急性粒细胞白血病细胞 HL-60,随机分为空白对照组、低浓度组、中浓度组和高浓度组,其中空白对照组给予生理盐水,低、中、高浓度组分别给予 10、25 和 50?mol/L 浓度的 PI3K/AKT/mTOR 信号阻断剂 GDC-0349 处理,采用CCK-8 法检测各组细胞增殖情况,流式
3、细胞仪检测各组细胞凋亡情况,蛋白质印迹检测 PI3K/AKT/mTOR信号、凋亡相关蛋白表达。结果 高浓度组细胞培养 24、48 和 72 h 时吸光度值(A)明显低于低浓度组和中浓度组(P0.05);低浓度组、中浓度组和高浓度组细胞凋亡率明显高于空白对照组(P0.05),其中高浓度组细胞凋亡率明显低于低浓度组和中浓度组(P0.05);高浓度组 P110、AKT 和 mTOR 蛋白相对表达量明显低于空白对照组、低浓度组和中浓度组(P 0.05);低浓度组、中浓度组和高浓度组 Bcl2 和Caspase3 蛋白相对表达量明显低于空白对照组(P0.05),高浓度组 Bcl2 和 Caspase3
4、蛋白相对表达量明显低于空白对照组、低浓度组和中浓度组(P 0.05)。结论阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号可抑制白血病 HL-60 细胞增殖,促进细胞凋亡。【关键词】PI3K/AKT/mTOR 信号;白血病;增殖;凋亡【中图分类号】R552Effect of Blocking PI3K/Akt/mTOR Signaling Transduction on Leu-kemia HL-60 CellsGUO Chen,TANG JingDepartment of Laboratory,Huangshi Key Laboratory of Chinical Laboratory Technol
5、ogy,SecondHospital of Huangshi,Huangshi,Hubei,435000,China【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of blocking PI3K/Akt/mTOR signaling onleukemia cells.MethodsAcute myeloid leukemia cell line HL-60 was selected,cells were ran-domly divided into 4 groups:blank control group,low concentration grou
6、p,medium concentrationgroup and high concentration group.Cells in the blank control group was given normal saline,cellsin the low concentration group,medium concentration group and high concentration group were trea-ted with 10,25 and 50?mol/L PI3K/Akt/mTOR signaling blocker GDC-0349.CCK-8 method wa
7、sused to detect the cell proliferation.Cell apoptosis was detected by flow cytometry,and the expres-sion level of PI3K/Akt/mTOR and apoptosis related proteins were detected by Western blot-ting.Results Compared with those in the low and medium concentration groups,the absorbanceratios(A values)of ce
8、lls in the high concentration group at 24,48 and 72 h time-points were sig-nificantly lower(P0.05).The apoptosis rates of cells in the low,medium and high concentrationgroups were significantly higher than that of cells in the blank control group(P0.05),and theapoptosis rate of cells in the high con
9、centration group was significantly lower than those of cells inthe low and medium concentration groups(P0.05).The relative expression levels of P110,Aktand mTOR in the high concentration group were significantly lower than those in the blank controlgroup,low and medium concentration groups(P0.05).Th
10、e relative expression levels of Bcl2 andCaspase3 proteins in the low,medium and high concentration groups were significantly lower thanthat in the blank control group(P0.05).The relative expression levels of Bcl2 and Caspase3 inthe high concentration group were significantly lower than those in othe
11、r groups(P0.05).Con-clusion Blocking PI3K/Akt/mTOR signaling can inhibit the proliferation and promote the apopto-sis of HL-60 cells.【Key words】PI3K/Akt/mTOR signal;leukemia;proliferation;apoptosis 急性粒细胞白血病主要表现为粒细胞的恶性增殖,患者临床表现为感染和出血,病情恶化容易导致患者死亡,大约 10%的病例进展缓慢,以老年人多发1。随着化疗方案的更新,急性粒细胞白血病的治疗效果和 5 年无病生存
12、率都有所增长,但无复发率和总生存率均低于 25%2。近年来,寻找特异性的药物靶向治疗成为白血病研究焦点。PI3K/AKT/mTOR 信号通路涉及蛋白质,脂质和核苷酸 的 合 成 过 程3。研 究 发 现4,PI3K/AKT/mTOR 信号路径的异常激活与白血病的形成有关。白血病起始细胞对 PI3K/AKT/mTOR 信号通路的异常激活可能导致白血病的复发和细胞耐药性产生5。使用 PI3K/AKT/mTOR 抑制剂作为治疗白血病单一药物或与常规化学疗法联合靶向治疗具有重要意义。为了探讨阻断 PI3K/AKT/mTOR 信号对白血病细胞的影响,本研究选取急性粒细胞白血病细胞 HL-60 进行研究。
13、1 材料与方法1.1 细胞选取急性粒细胞白血病细胞 HL-60,购自于上海吉凯基因化学技术有限公司。1.2 试验方法1.2.1 细胞培养 将 HL-60 细胞置于含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养基,在37 和5%CO2的环境下进行培养,实验使用处于对数生长期的细胞。1.2.2 细胞处理 将5 mg GDC-0349 溶解于2.2097mL 的 DMSO 中,来回摇动混合制成5 mmol/L 的存储溶液,-20 保存。用 PBS 将储备溶液稀释至相应浓度(10、25 和50?mol/L)的工作溶液,向细胞悬液中加入各种药物浓度,轻轻搅拌,再在37、5%CO2的培养箱中放置指定时间,
14、随后收集细胞。1.2.3 CCK-8 法检测空白组:100 L 含 10%胎牛血清的 1640 培养基;A 值:包含不同浓度的GDC-0349 HL-60 细胞和 CCK8 溶液的孔的吸光度。对照组:100 L 含 0.1%DMSO 的 HL-60 细胞悬液;A 值:含有 10%胎牛血清和不含 HL-60细胞的 CCK8 溶液的孔的吸光度。实验组:100 L 分别含 10、25 和 50 mmol/L的 GDC-0349 的 HL-60 细胞悬液;A 值:HL-60 细胞和含有 0.1%DMSO 的 CCK8 溶液的吸光度。96 孔板周围添加100 L PBS 以减少边缘效应,并在培养箱中培养
15、。在0、12、24、48 和72 h 时,向各组加入10 L CCK-8,避免气泡并在培养箱中额外培养2h。最后,使用酶标仪测定450 nm 波长的吸光度。细胞增殖抑制率(%)=实验组 A-空白组 A/对照组 A-空白组 A100%。1.2.4 流式细胞仪检测经处理的 HL-60 细胞经离心后用 PBS 清洗,再重悬于含 100 L 1 bind-ing buffer 的流式管中。加入 5 L Annexin,在室温下避光孵育15 min。用1 binding buffer 清洗后,再次离心,将细胞悬浮在含 400 L 1 bindingbuffer 的流式管中,加入5 L PI,随后用流式细
16、胞仪进行细胞凋亡分析。1.2.5 蛋白质印迹测 实验组细胞收集后,使用加入 PMSF 的 RIPA 裂解缓冲液在冰上裂解 20 min离心后取上清。利用 BSA 法测定蛋白浓度,取等量蛋白进行SDS-PAGE 分离,后转移到 PVDF 膜上。使用 5%脱脂奶粉的 TBST 在室温下封闭 1 h,用 TBST 洗涤3 次后,在 4 下一抗孵育过夜(除了 Bcl2 和GAPDH 抗体的稀释比为 1 500 外,所有的一抗(Caspase3,P110,AKT 和 mTOR)的稀释比均为11 000),用 TBST 洗涤 3 次,用 HRP 标记的二抗孵育(用 TBST 15 000 稀释)45 mi
17、n,用 TBST 洗涤 3 次,加入 ECL 曝光。1.3 统计学处理采用 SPSS22.0 软件,A 值、细胞凋亡率等以均数 标准差(x s)表示,F 检验分析组间差异,检验水准?为 0.05。2 结果2.1 各组细胞增殖情况比较各组随培养时间延长,A 相对值有所升高(P0.05);低浓度组、高浓度组细胞培养 24、48 和72 h 时 A 相对值明显低于低浓度组和中浓度组(P0.05)(表 1)。2.2 各组细胞凋亡情况比较低浓度组、中浓度组和高浓度组细胞凋亡率明显高于空白对照组(P 0.05),其中高浓度组细胞凋亡率明显低于低浓度组和中浓度组(P 0.05)。(表 2、图 1)。552医
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