响应面优化乳杆菌菌株产共轭亚油酸的工艺研究.doc
《响应面优化乳杆菌菌株产共轭亚油酸的工艺研究.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《响应面优化乳杆菌菌株产共轭亚油酸的工艺研究.doc(73页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、响应面优化乳杆菌PC-3菌株产共轭亚油酸的工艺研究摘 要:以共轭亚油酸(CLA)转化率为考察指标,研究乳杆菌PC-3菌株转化生产CLA的发酵工艺。在单因素实验中考察培养基种类、乳糖与硫酸铵添加量比、菌液接种量、培养时间、亚油酸添加量、吐温-80添加量对CLA转化率影响的基础上,采用三因素三水平响应面实验设计优化乳杆菌PC-3菌株产共轭亚油酸的工艺条件。结果表白:乳杆菌PC-3菌株产共轭亚油酸的较佳条件为:诱导培养基为MRS培养基、乳糖与硫酸铵添加量比3:2、接种量3.0%、培养时间43.0h、亚油酸(LA)添加量(体积分数)1.30、乳化剂吐温-80添加量2.00g/L,此条件下CLA转化率达
2、成6.87%,理论值可达6.96%,实验值与理论预测值的相对误差为1.29%。关键词:共轭亚油酸;乳杆菌PC-3;响应面分析法;优化Optimization of Medium Composition and Culture Conditions for Conversion of Linoleic Acid toConjugated Linoleic Acid by Lactobacillus PC-3Abstract:Themediumcompositionandcultureconditionsforconversionoflinoleicacid(LA)toconjugatedlino
3、leicacid(CLA)byLactobacillusPC-3wereoptimizedbyresponsesurfacemethodologytoobtainmaximumconversionefficiencyofCLA.Culturemediumtype,lactose/ammoniumsulfateconcentrationratio,inoculumsamount,culturetime,LAconcentrationandTween-80concentrationwereinvestigatedbyone-factor-at-a-timeexperiments.Athree-va
4、riable,three-levelresponsesurfacedesignwasusedtooptimizeinoculumamount,culturetimeandLAconcentration.TheresultsshowedthattheoptimalconversionconditionsofLAwasMRSmedium,inoculumsamountof3.0%,culturetimeof43.0h,LAconcentrationof1.30andTween-80concentrationof2.00g/L.Undertheoptimizedconditions,theexper
5、imentalconversionefficiencyofCLAwas6.87% compared to 6.96% from theoretical predictions, showing a relative error of 1.29% between both.Key words:conjugated linoleic acid;LactobacillusPC-3;response surface methodology;optimization中图分类号:Q815文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)19-0213-06doi:10.7506/spkx1002-4
6、收稿日期:2023-07-30基金项目:安徽省年度重点科研项目()作者简介:章立新(1987),女,硕士研究生,研究方向为食品生物技术。E-mail:*通信作者:王武(1968),男,副专家,硕士,研究方向为农产品生物化工。E-mail:共轭亚油酸(conjugatedlinoleicacid,CLA)是由必需脂肪酸中的亚油酸(linoleic acid,LA)衍生的,是具有共轭双键的18碳原子的不饱和脂肪酸的多种位置和几何异构体的总称1。研究发现2-3,c9,t11-CLA和t10,c12-CLA具有增强免疫调节、抗动脉粥样硬化、克制癌症、减肥、抗氧化等生理功能及保健作用,同时,CLA还具有
7、改善骨组织代谢、调节血糖4等功效。目前,CLA重要由化学法和生物法合成得到,化学合成法的产物异构体众多,成分复杂,分离提纯困难,制约了其在食品医药领域的应用,也导致CLA单体在该领域处在垄断地位5。生物合成法因其反映条件温和,产物成分较单一,在食品医药领域展现出了良好的应用潜力。目前,用来生物合成CLA的微生物重要有丁酸弧菌(Butyrivibrio)、丙酸杆菌(Propionibacterium)、乳酸杆菌(Lactobacillus)等,这些菌株均可经诱导产亚油酸异构酶,转化生产具有生物活性的CLA。但丁酸弧菌需要严格厌氧培养,合成的异构体种类较复杂,应用受到限制;而乳酸菌系益生菌,且酶的
8、作用位点在脂肪酸的c12双键上,能把LA转化为c9,t11-CLA,产物可直接从细胞培养液中提取6,其发酵条件温和、易控制,生产设备简214 2023, Vol.34, No.19 食品科学 生物工程单,具有工程化的应用潜力,筛选较高的CLA转化率的乳酸菌属菌株仍是当前的研究热点。PC-3菌株系从黄瓜泡菜、萝卜泡菜、豇豆泡菜等环境中筛选出,能转化亚油酸为具有生理活性的共轭亚油酸(c9,t11-CLA和t10,c12-CLA),经形态学、生理生化实验及16S rDNA序列分析,结合气-质联用仪检测方法,鉴定PC-3菌株为乳杆菌属,该菌株能转化LA为具有生理活性的CLA。本实验以该菌株为研究对象,
9、优化其发酵生产CLA的工艺条件。该工艺条件易实行、易实现工业化。1 材料与方法1.1材料、试剂与仪器1.1.1菌种与培养基乳杆菌PC-3,自黄瓜泡菜、萝卜泡菜、豇豆泡菜等环境中分离出。MRS培养基,121灭菌20min;脱脂乳培养基(12g/100mL),115灭菌15min。1.1.2试剂亚油酸C18:2(LA含量(951)%,酸值190mgKOH/g,水分含量0.1%)安庆市中创生物工程有限公司;共轭亚油酸(CLA含量99%)、CLA甲酯(99%)美国Sigma公司;c9,t11-CLA(含量90%)、t10,c12-CLA(含量90%) Nucheckprep公司;正己烷 江苏强盛功能化
10、学股份有限公司;脱脂奶粉(脂肪含量1.5g/100g,优质蛋白含量32g/100g)内蒙古伊利实业集团股份有限公司。1.1.3仪器与设备SW-CJ-1F超净工作台 苏净集团安泰公司;HQ45Z恒温摇床 中国科学院武汉科学仪器厂;CT14RD台式高速冷冻离心机 上海天美生化仪器设备工程有限公司;CP-Sil 88色谱柱(100m0.25mm,0.20m)美国Varian公司;QP-2023气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司。1.2 CLA的测定及标准曲线制定1.2.1 GC-MS检测条件7气-质联用仪CP-Sil 88色谱柱(100m0.25mm,0.20m),升温程序为70维持10min,以5
11、/min速率升温至170,维持15min,再以2/min升温至190,1/min速率升温至210,维持20min。进样口温度为220,检测器温度为220;柱前压为182.2kPa,柱流速为0.8mL/min;氢气流速为50.0mL/min,空气流速为400.0mL/min;分流比为1:30;进样量为1L。采用电子电离源(EI),离子阱温度为250,连接口温度为220,采用全离子扫描方式,扫描质量(m/z)范围为100350。1.2.2 CLA标准曲线的制定吸取200L的CLA甲酯标准样品,正己烷定容于25mL的容量瓶,配制为8L/mL,分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6
12、mL定容至1mL,转移至7个气相色谱自动进样瓶中,进行GC-MS分析。并以CLA的添加量为横坐标(x,L/mL),峰面积为纵坐标(y,104),建立CLA气相色谱标准曲线,得出回归方程y=3.0246x0.0604(R2=0.9989),线性相关范围04.8L/mL。1.3 CLA转化率的测定1.3.1诱导产酶与发酵培养菌株接种于MRS液体培养基活化2次后,以体积分数2.5%的接种量接种乳杆菌PC-3菌株于添加有1.50亚油酸的MRS液体培养基中,诱导菌株产亚油酸异构酶(其转化LA为CLA)8-10,37恒温120r/min摇床培养36h,获得具有共轭亚油酸异构酶的菌细胞。再次转接菌株,进行发
13、酵产CLA的优化实验。1.3.2分离萃取发酵后的培养液经4、6000r/min离心10min,取发酵液。采用正己烷萃取发酵液,静置,收集上面的正己烷层。在正己烷溶液中加入无水硫酸钠吸水干燥,于30旋转蒸发,去除有机溶剂,得脂肪酸提取物收集在试管中,备用。1.3.3脂肪酸甲酯的制备加入25L的脂肪酸提取物和1mL的2% H2SO4甲醇溶液于试管中,在55条件下进行甲酯化(10min),随后用正己烷萃取,蒸馏水洗涤2次,静置,取上层待测。由CLA标准曲线得CLA含量,再根据底物LA的添加量计算出CLA的转化率(每个水平实验3次)。转化率/%= 100CLA含量/(L/mL)LA添加量/(L/mL)
14、1.4单因素及响应面实验以CLA的转化率为响应指标,拟定较适的发酵培养基(MRS液体培养基与脱脂乳培养基),考察乳糖与硫酸铵添加量比、菌液接种量、培养时间、底物LA添加量、乳化剂吐温-80的添加量对CLA转化率的影响。1.4.1发酵培养基的种类对CLA转化率的影响MRS液体培养基和脱脂乳培养基都可以作为菌株的发酵培养基,以乳杆菌PC-3菌株为研究对象,活化2次后转接于这两种培养基。亚油酸添加量为1.50,菌液接种量为2.5%,混匀后于37、120r/min摇床培养24h。然后正己烷萃取发酵液,测得菌体对CLA的转化率。1.4.2乳糖与硫酸铵的添加量比对CLA转化率的影响发酵培养基中乳糖和硫酸铵
15、的添加量比分别为2:1、3:2、1:1、2:3、1:2(其中乳糖添加量依次分别为0.20、0.18、0.15、0.12、0.10g/100mL),亚油酸添加量为1.50,经LA诱导过的菌液接种量为2.5%,37、120r/min摇床培养24h。以不添加乳糖和硫酸铵的发酵培养基作为参照,考察CLA的转化率情况。生物工程 食品科学 2023, Vol.34, No.19 2151.4.3菌液接种量对CLA转化率的影响乳糖和硫酸铵的添加量比为3:2,亚油酸添加量为1.50,经LA诱导过的菌液接种量为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%的发酵条件下,37、120r/min摇床培养24h后分
16、别测得CLA的转化率。1.4.4培养时间对CLA转化率的影响乳糖和硫酸铵的添加量比为3:2,亚油酸添加量为1.50,经LA诱导过的菌液接种量为2.5%,发酵培养时间分别为12、24、36、48、60h,37、120r/min摇床培养。然后测得CLA的转化率。1.4.5底物亚油酸的添加量对CLA转化率的影响考察亚油酸添加量分别为0.50、1.00、1.50、2.00、2.50对菌体生长的影响。乳糖和硫酸铵的添加量比为3:2,经LA诱导过的菌液接种量为2.5%,37、120r/min摇床培养36h。1.4.6乳化剂吐温-80的添加量对CLA转化率的影响底物亚油酸添加量为1.50,其他条件相同的情况
17、下,考察吐温-80的添加量分别为0、0.50、1.00、1.50、2.00g/L对CLA转化率的影响。1.4.7响应面实验设计通过Excel软件进行单因素方差分析。在此基础上,选出具有显著性差异的3个影响因素(接种量、培养时间、亚油酸添加量)进行响应面实验。按Box-Behnken中心组合设计原理,拟定3个影响因素水平的中心点,取3个水平。2 结果与分析2.1 GC-MS检测结果0.00.51.01.550 55 60 65 70 75LAabA/minV(m017)100755025050 100 150 200 250 300OOOBm/z%/67815559413844959310912
18、3135150164178207220234263281294313100755025050 100 150 200 250 300OOCm/z%/678155594138449593109123135150164178207220234263281294313A.气相色谱图;B. a峰的质谱图;C. b峰的质谱图。图 1 气相色谱图与质谱图Fig.1 GC-MS analysis of CLA sample由图1可知,a峰和b峰能较好的分离开(图1A),出峰时间分别为65.905min和66.551min,与c9,t11-CLA甲酯、t10,c12-CLA甲酯的出峰时间相吻合,并具有分子离子
19、峰m/z为294(图1B、C)。说明a峰为c9,t11-CLA,b峰为t10,c12-CLA11-13,乳杆菌PC-3菌株能将LA转化为两种具有生物活性的CLA异构体c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。2.2发酵培养基的种类对CLA转化率的影响01234567MRSLAC%/图 2 两种培养基对CLA转化率的影响Fig.2 Effect of culture media on the conversion efficiency of CLA由图2可知,转接经LA诱导后的菌株进行发酵培养的CLA转化率要高于直接进行诱导培养的,证实了乳杆菌PC-3菌株产生亚油酸异构酶转化LA为CLA,减
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 响应 优化 杆菌 菌株 共轭 油酸 工艺 研究
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【精***】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【精***】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。