流式细胞仪操作规程-SOP.doc

流式细胞仪操作规程目录

1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数
2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测
3：HLA-B27测定
4：CD55／CD59测定
5：干细胞检测和绝对计数
6：白血病免疫分型测定
7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定
8：细胞周期分析
9：活化血小板检测
10：血小板抗体测定
11：红细胞抗体测定
12：粒细胞抗体测定

淋巴细胞亚群测定
(流式细胞仪)
医院检查科
操作规程文献号：
200 年 月 日起实行
第1版
(共3页)
本规程每2年复审一次
复审日期： 年 月 日
复审人：
规程编写者：
审 批 者：
批准日期： 年 月 日
文献分发部门和／或个人
院档案室保管者：
检查科 主任：
检查科 实验室：

淋巴细胞亚群测定

方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，通过溶血、洗涤（和固定）等环节后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；克制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，运用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。
标本采集与解决
受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
规定 1．样本量1ml。
2．样本应在采集后6小时内解决，冷冻或溶血的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
试剂
品牌 剂型 规格 贮存
贝克曼库尔特
成分 1：单克隆抗体 液体 2—8℃
(CD45/4/8/3 No.6607013 CD45/56/19/3 No.6607073
CD4/8/3 No.IM1650 同型对照IgG1/IgG1/IgG1 No.IM1672
CD3/19 No.IM1293 CD3/16+56 No.IM2076 CD19-PC5 No.IM2643
Flow-Count荧光微球 No.7547053)
2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946)
A：甲酸 液体 70ML 室温
B：碳酸钠等 液体 32ML 室温
C：多聚甲醛 液体 14ML 室温
(Optilyse C No.IM1401) 液体 室温
3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温
4：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温
5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8℃(Flow-Check)

仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra
样本制备：
1)按照规定，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟
4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血)
b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）
6)需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，并且加完即上机)
报告结果
报告百分数（和绝对值）
操作性能
精密度 批内五次反复CV<2％

参考值(百分数（绝对值）)
CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072)
CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567)
Th/Ts 1.05-2.03
临床意义
1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。
临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。
Th／Ts比值升高：表达免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。
Th／Ts比值减低：表达免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。
2：NK细胞重要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起重要作用。NK活性减低重要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫克制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反映和移植物抗宿反映，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增长。
方案（Protocol）
1.选参数
点击

点击

4色

3色
点击

（命名，点击save）
2.画图

结果

此图为CD45圈门

假如做绝对计数，则

填写Flow-Count的浓度

选中cell/ul即可

活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的测定

方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，通过溶血、洗涤（和固定）等环节后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到相应各亚群的百分数。活化淋巴细胞表面抗原为CD3+/CD25+和CD3+/HLA-DR+。CD3+/CD45RO+是记忆型T细胞。CD3+/CD45RA+是纯真型T细胞。
标本采集与解决
受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
规定 1．样本量1ml。
2．样本应在采集后6小时内解决，冷冻或溶血的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
试剂
品牌 剂型 规格 贮存
贝克曼库尔特
成分 1：单克隆抗体 液体 2—8℃
(CD3/HLA-DR No.IM1295 CD25-PC5 No.IM2646
CD3-FITC No.IM1281 CD45RA-PE No.IM1834
CD45RO-PE No.IM1307 CD4-PC5 No.IM2636 ）
2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946)
A：甲酸 液体 70ML 室温
B：碳酸钠等 液体 32ML 室温
C：多聚甲醛 液体 14ML 室温
(Optilyse C No.IM1401) 液体 室温
3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温
4：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温
5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8℃(Flow-Check)

仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra
样本制备：
1)按照规定，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟
4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血)
b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）
报告结果
报告百分数
操作性能
精密度 批内五次反复CV<2％

参考值(百分数)
CD3+/HLA-DR+ 3.1±1.3% CD3+/CD25+ 15.9±3.7%
CD3+/CD45RO+ 3.3±1.55% CD3+/CD45RA+/CD4+ 20.51±3.64%

临床意义
1.HLA-DR、CD25、CD69是T细胞活化各个时期表达的标志性抗原，对其进行检测可以判断出疾病的进程，有助于临床疾病的辅助诊断、预后和治疗。如活化状态的监测是对机体移植免疫状况判断的最重要依据，有助于临床选择治疗方案，CD25+/CD3+ >5-10%提醒排斥、连续增长提醒应作病理活检；CD3+/HLA-DR+增长5-10%但不伴CD25增长提醒MCV感染。
2.正常机体内各种T细胞之间以及与其他免疫细胞之间在数量上保持一定比例，假如它们之间比例失调就会引起免疫功能紊乱，将导致机体免疫力下降和感染性疾病、自身免疫病、肿瘤等疾病的发生，检测淋巴细胞各种亚群有助于疾病的诊断、预后和治疗。CD45RA、CD45RO均为T细胞的辅助分子，CD45RA+纯真型T细胞当免疫力下降时减少；CD45RO+记忆型T细胞对第二次抗原刺激极其敏感，通常在急性感染疾病中增长，在慢性感染疾病中减少。

方案（Protocol）
同淋巴细胞亚群检测
结果（Result）

HLA-B27测定

方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，通过溶血、洗涤（和固定）等环节后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的比例。
标本采集与解决
受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
规定 1．样本量1ml。
2．样本应在采集后6小时内解决，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。
4．溶血样本不能用。
试剂
品牌 剂型 规格 贮存
贝克曼库尔特
成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃
(HLA-B27/HLA-B7 No.IM1502 同型对照IgG1／IgG2a No.IM1389))
2：全血溶血试剂 液体
A：甲酸 液体 70ML 室温
B：碳酸钠等 液体 32ML 室温
C：多聚甲醛 液体 14ML 室温
3：鞘液 液体 20L 室温
4：清洗液 液体 5L 室温
5：荧光微球 液体 10ML 2-8℃

质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；天天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。

仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra
样本制备：
1)按照规定，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC／IgG1-PE)
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟
4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血)
b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
5)洗、离心、上机测样（备注： 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）
报告结果
报告阴阳性
操作性能
精密度 批内五次反复CV<2％

参考值
阳性：HLA-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在5.0以上，阳性率>90%。
临床意义
HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，特别是强直性脊柱炎。HLA-B27基因属于І型MHC基因，所有有核细胞上均有表达，特别是淋巴细胞表面含量丰富，人们发现HLA-B27抗原表达与强直性脊柱炎有高度的相关性，超过90%的强直性脊柱炎患者HLA-B27抗原表达阳性，而正常人群中仅5-10%的认为阳性。由于强直性脊柱炎症状与许多疾病相类似，临床上难以确诊，因此HLA-B27检测在疾病的诊断中具有重要意义，HLA-B27的检测是该疾病诊断和鉴别诊断中的一个重要指标。

方案（Protocol）
1.选参数
点击

点击

键入文献名，点击Save
2.画图

结果
1. positive (+)

X-Mean=17.1
2. negative(-)

X-Mean=1.2 X-Mean=5.8

CD55/CD59测定

方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
双色直接免疫荧光法。近年的研究表白，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺少表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。
标本采集与解决
受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
规定 1．样本量1ml。
2．样本应在采集后6小时内解决，冷冻的标本不能用。
3．溶血样本不能用。

试剂
品牌 剂型 规格 贮存
贝克曼库尔特
成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃
(CD59-FITC No.IM3457 CD55-PE No.IM2726)
2：全血溶血试剂 液体
A：甲酸 液体 70ML 室温
B：碳酸钠等 液体 32ML 室温
C：多聚甲醛 液体 14ML 室温
3：鞘液 液体 20L 室温
4：清洗液 液体 5L 室温
5：荧光微球 液体 10ML 2-8℃

质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；天天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。

仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra
样本制备:
(一)白细胞CD55／CD59检测
1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。
2．溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血)
b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
3．离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。
4．洗涤离心
5．上机测样
(二)红细胞CD55／CD59检测
1．准备2支流式细胞仪专用管，分别标记
2．分别加入CD55／CD59 10ul和相应的同型对照10ul。
3．向二管中加入1：200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。
4．洗涤离心。
5．混匀、上机测样。
报告结果
报告百分数
操作性能
精密度 批内五次反复CV<2％

参考值
CD55>97% CD59>97%
PNH的临界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90%
PNH的诊断值：RBC CD59>91% 大部分>80%
中性粒细胞CD59>84%
临床意义
用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。
方案（Protocol）(同HLA-B27)

结果
1.RBC: normal

2.RBC: abnormal

3.WBC

干细胞检测和绝对计数

方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与干细胞膜上相应的抗原结合，通过溶血、洗涤（和固定）等环节后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。
标本采集与解决
受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血
规定 1．样本量1ml。
2．样本应在采集后6小时内解决，冷冻或溶血的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
试剂
品牌 剂型 规格 贮存
贝克曼库尔特
成分 1：单克隆抗体 液体 2—8℃
(CD34 No. IM1871 CD45-PC5 No.IM2653/IM2652
Flow-Count荧光微球 No.7547053)
2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946)
A：甲酸 液体 70ML 室温
B：碳酸钠等 液体 32ML 室温
C：多聚甲醛 液体 14ML 室温
(Optilyse C No.IM1401) 液体 室温
3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温
4：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温
5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8℃(Flow-Check)

仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra
样本制备：
1)按照规定，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照
2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。
3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟
4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血)
b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
5)需要做绝对计数时，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，并且加完即上机)
6)上机测样
报告结果
报告百分数（和绝对值）
操作性能
精密度 批内五次反复CV<2％

参考值(百分数（绝对值）)
CD34+/CD45+ 0.58±0.29%
临床意义
目前把CD34作为造血干细胞的重要标志，CD34阳性细胞计数作为造血干细胞水平定量的检测方法。

方案（Protocol）
同淋巴细胞亚群检测
结果（Result）

白血病免疫分型测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与细胞膜上或膜内相应的抗原结合，通过溶血、洗涤（和固定）等环节后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到百分数。
标本采集与解决
受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。
采集部位 骨髓采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝
规定 1．样本量1ml。
2．样本应在采集后6小时内解决，冷冻或溶血的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
试剂
品牌 剂型 规格 贮存
贝克曼库尔特
成分 1：单克隆抗体 液体 2—8℃
(CD34 No. IM1871 CD45-PC5 No.IM2653/IM2652
Flow-Count荧光微球 No.7547053)
2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946)
A：甲酸 液体 70ML 室温
B：碳酸钠等 液体 32ML 室温
C：多聚甲醛 液体 14ML 室温
(Optilyse C No.IM1401) 液体 室温
3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温
4：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温
5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8℃(Flow-Check)

仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra
操作-样本制备：
细胞膜表面抗原
1．一方面准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。
2．一方面每管中加入5ul CD45-PC5抗体。
3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)
4．各管中加入标本(骨髓或外周血)30～100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光20～30分钟。
5．溶血：a. OptiLyse C(按说明书环节溶血)
b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）

细胞浆和核抗原
1．准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。
2．一方面每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。
3．每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。
4．各管中加入PBS4ml。
5．300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)
6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。
7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。
8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。
9．300g离心5分钟后，弃去上清液。
10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。
11．上机测样
报告结果
报告百分数
操作性能
精密度 批内五次反复CV<2％
参考值
CD34+<5% MPO+<5%
粒系<20% 淋系<30%
临床意义
用于血液病的诊断和分型诊断
方案（Protocol）

T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4检测

方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-γ、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，运用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运克制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量)，然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-γ和IL-4进行测定。
标本采集与解决
受检者的准备 检核对象生活饮食处在平常状态。
采集部位 静脉采血
抗凝剂 肝素抗凝血
规定 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内解决，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。
4．溶血样本不能用。
试剂
淋巴细胞培养体系(自配)
成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。
选白美国SIGMA公司。
单克隆抗体 ( BeckmanCoulter公司)
CD4-PC5(No.IM2636)、IL-4-PE(No.IM2719)、IFN-γ-FITC(No.IM2716)。

质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；天天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。

仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra
操作：
细胞培养与染色
取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5％C02 37℃孵育18小时，取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞提成两管，其一为测定管加入lOul抗人IL-4-PE和IFN-γ-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。
流式细胞仪测定
打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-γ-FITC的表达。
●淋巴细胞在FS／SSC散点图中位置，即A门内细胞；
●A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞；
●B门内TH细胞亚群分布：
1区数值---Th 1细胞 (%)
4区数值---Th 2细胞 (%)
2区数值---Th 0细胞 (%)
报告结果
报告百分数
操作性能
精密度 批内五次反复CV<2％

正常参考值
Thl(IFN-γ)：17.39±5.52% Th2(IL-4)：1.50±0.44%
ThO ：0.51±0.26%
临床意义
淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞重要分泌IL-2，IL-12，IFN-γ和TNF-b／a等，Th2细胞重要分泌IL-4．IL-5．IL-6，IFN-γ为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN-γ+，Th2为IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅具有很少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN-γ和IL-4也微乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-γ和IL-4也较多。本实验的检测事实上是检测Th细胞对刺激素刺激的反映能力。
方案（Protocol）

细胞周期分析

方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
运用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等) 与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量

标本采集与解决
检测对象 实体（肿瘤）组织、灌洗液、石蜡块、培养细