PCR污染防治手册.doc
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1、PCR污染防治手册一、 为什么要如此重视防治PCR污染?聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。扩增过程中,扩增的DNA产量是呈指数上升的。PCR产物的浓度一般为1013拷贝/ml,而1mg人基因组DNA才含1.4*106拷贝的单拷贝基因片段,因此使得PCR扩增反应的敏感性非常高。正是由于PCR反应具有强大的扩增效率也导致其及易污染,极微量的PCR产物污染便可导致假阳性结果。在应用HPV分型试剂盒的过程中,主要存在两个污染源:1.标本间的交叉污染; 2.PCR扩增产物的污染。其中以第二个污染源为最为常见,通过下面一个例
2、子便可认识到PCR产物污染的严重性。在100ml的反应管中可产生1012拷贝个分子,若将这些分子在一个标准奥林匹克游泳池(50m*25m*2m)内稀释后,0.1ml稀释液含有400拷贝的扩增分子,远远超过了PCR扩增反应检测数个拷贝的极限。因此,一定要注意产物残留污染的问题,对临床实验室尤应如此。二、 PCR污染的来源对于HPV分型检测试剂盒来说,污染的来源主要是PCR扩增产物的污染,常见的污染途径有两种,一是气溶胶污染,在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及受污染的进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由
3、其造成的污染是一个值得特别重视的问题。二是PCR产物的粘带污染,此类污染多是因为没有严格遵守分区规定,造成PCR产物扩散到样品抽提或PCR实验室。实验大衣、手套、移液枪、枪头、枪头盒和试管架都是常见的粘带污染源。污染发生时,这些地方是重点怀疑的地方。三、 PCR污染的追踪如果不慎发生或者怀疑有污染发生,可以设计一个简单的小实验以确认污染源。用HPV的PCR扩增系统扩增如下模板:A:水-作为阴性对照,如果此管扩增出阳性,则可以判定为试剂已经污染或者是气溶胶污染。B:阳性样品-作为阳性对照,验证实验是否成功。C-X:-所要检查的地方,用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源,0.1ml 去离子水浸泡
4、后作为模板。常见的需要检查的地方为各个实验台面、移液枪、枪头、枪头盒、试管架、冰箱内、冰箱把手、水浴锅、抽提的相关试剂以及相关人员的办公桌。如果经过上述追踪实验,仍不能查找到确切污染源,则污染可能是由空气中PCR 产物的气溶胶造成的,此时就应该更换实验场所,若条件不允许,可以在室内加装紫外灯管照射过夜且彻底通风并停止几天的实验。四、 PCR污染的预防进行PCR 操作时,操作人员应该严格遵守一些操作规程,最大程度地降低可能出现的PCR 污染或杜绝污染的出现。1、划分操作区:实验操作在三个不同的区域内进行,PCR 的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行, 最基本的一个原则就是PCR扩增及杂交检测区
5、的东西是属于污染源,绝对不可以带到前两个区去。A:样品制备区,包括扩增摸板的制备;B:PCR 加样区,包括反应液的配制和PCR 扩增;C:PCR扩增及杂交检测区,杂交操作过程在这个地方完成。分区的注意事项:各工作区要有一定的隔离,操作器材专用,要有一定的方向性。如:标本制备PCR扩增产物分析产物处理。样品的保存应该在上述三个区以外单独的区域。各个区域的物品及衣服必须严格遵守单向的原则。各个区域必须要自己单独的实验衣,实验时必须戴上手套。每个区域要有自己单独的实验设备。以下是常见的分区方式: 缓冲间缓冲间缓冲间样品制备区PCR加样区PCR扩增及杂交检测区样品制备及PCR加样区PCR扩增及杂交检测
6、区缓冲间缓冲间PCR扩增及杂交检测区样品制备区PCR加样区 图一 图二走廊PCR扩增及杂交检测区PCR加样区样品制备区图四图二 图三2、实验操作的注意事项:A: 戴一次性手套,若不小心溅上反应液,立即更换手套;B: 使用一次性吸头,严禁与PCR 产物分析室的吸头混用,吸头不要长时间暴露于空气中,避免气溶胶的污染;C: 避免反应液飞溅,打开反应管时为避免此种情况,开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上,应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面;D: 操作时设立阴阳性对照和空白对照,即可验证PCR 反应的可靠性,又可以协助判断扩增系统的可信性;E:尽可能用可替换或可高压处理的加样器,由于加样器
7、最容易受产物气溶胶或标本DNA 的污染,最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器,至少应经常的擦洗枪外表及枪管内。3、严格对PCR产物的处理: PCR产物包括杂交产物,在读数结束后,杂交产物或PCR产物应该用一次性密闭容器(垃圾袋、自封袋)装好后丢弃或者倒至1 mol/L HCl溶液或1:25的84消毒液中,浸泡半小时以上后再行丢弃。如果有产物溅在了桌面或器具上,应立即用1 mol/L HCl溶液或1:25的84消毒液擦拭。4、根据实验室情况建立完善的日常PCR防治制度并严格执行 事在人为,制度执行了才能达到它应有的效果,根据实验室实际情况建立制度后必须严格执行,绝对不能因为图
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