比较基因组杂交原理.doc
《比较基因组杂交原理.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《比较基因组杂交原理.doc(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、1CGH的基本原理CGH是一种将消减杂交和FISH相结合,用于检测两个(或多个)基因组间相对DNA拷贝数变化(如扩增、增益(gains)、复制和丢失等),并将这些异常定位在染色体上,因此又称DNA拷贝数核型(DNA copy number karyotype)技术4。与传统的原位杂交方法相反,该法不是将单一的、已定的DNA探针杂交在受检的分裂中期或间期的细胞上,而以被检组织的基因组DNA为杂交检测样本,正常组织的DNA样本为参照,分别用不同颜色的荧光标记,两者按11混合,与正常淋巴细胞中期染色体进行杂交(即反向原位杂交),再通过检测两种颜色的荧光强度,根据颜色的比例来显示基因组的结构状况。如果
2、探针中某一染色体或染色体亚区呈现过度表达或低表达,则在正常染色体的相应区域内便呈现较强或较低的信号,表明该区域存在DNA序列的增益或丢失5。2CGH的基本方法随着CGH技术的广泛应用,其操作方法已逐步完善,经验表明,CGH技术的建立和常规应用,对每一步操作都必须细致。CGH的主要步骤包括:(1)正常中期染色体的制备;(2)从肿瘤组织中分离高分子量的基因组DNA;(3)用不同的haptens标记正常和肿瘤DNA;(4)标记的DNA与正常中期染色体原位杂交;(5)荧光显微镜检查和数字化图像分析;(6)对中期染色体产生的绿红荧光密度比率相对应的拷贝数异常进行分析35。2.1正常中期染色体的制备正常中
3、期染色体充当CGH杂交的靶,CGH分析的质量主要依赖中期染色体的特性,中期染色体的制备采用常规PHT刺激和氨甲喋呤同步化处理的外周血淋巴细胞培养技术,一次应制备大量片子,以保证整个实验都使用同一批片子。此外,对制备的中期染色体玻片应选择重叠较少,形态保持较好,染色体较长的标本。2.2肿瘤标本的选择和基因组DNA的分离分离DNA的标本应尽可能的选择具有典型肿瘤组织学特征和比例高的恶性细胞,弃除坏死组织和炎症区域及周边正常细胞,因其中含有坏死细胞降解的DNA和一些正常细胞,可显著消弱拷贝数改变的分辨能力。从肿瘤细胞和组织中提取高分子量DNA的方法均可用于CGH。福尔马林固定、石蜡包埋切片亦可获得相
4、对高分子量的DNA,由于石蜡包埋组织提取的DNA浓度不足进行直接标记缺口平移法(nick translation),因此肿瘤DNA应用兼并引物PCR(degenerate oligonucleotide-primed PCR, DOP-PCR)扩增和标记,采用通用引物PCR(UN1-primer, 5-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG-3, N=A,C,G或T)扩增和标记5。2.3正常和肿瘤DNA的标记基因组DNA的标记可采用缺口平移法、随机引物法(random priming)和DOP-PCR等技术,通常采用生物素-14-dATP标记肿瘤DNA,地高辛-11-dUTP标
5、记正常DNA,亦可用直接荧光素连接核苷酸,如FITC-dUTP和Texas Red-dUTP。与着丝粒和粘粒探针相比,缺口翻译法后的基因组探针片断长度范围在6002000 bp,在缺口翻译反应中可通过调整DNase和DNA聚合酶的比例获得相应的DNA片断长度。2.4CGH杂交和染色CGH杂交和染色基本遵循粘粒探针的染色体涂染和FISH技术,杂交中将一定比例不同标记的检测和参照DNA混合,并加入Cot-1 DNA以阻断重复序列对杂交结果的干扰,特别是近端着丝粒和异染色质区的比率改变。为了获得足够的DNA浓度,标记的DNA和阻断的DNA应充分混合。每次杂交前的变性时间和温度、蛋白酶K的量均不一样,
6、应适应调整以达到最完全的变性和最佳探针穿透,但应避免破坏DAPI带型,一般在37湿度的小室中覆以盖玻片杂交24天,按照标准的FISH技术洗掉未结合的探针,如果用间接法标记探针时,用FITC(肿瘤DNA呈绿色荧光)和抗地高辛-罗丹明(正常DNA呈红色荧光)免疫组化染色。2.5荧光镜检和多彩数字图像分析CGH分析主要依赖两种荧光素的相对强度,由多彩荧光显微镜和计算机多彩图像分析仪将荧光信号进行定量处理,评价沿染色体长轴分布的两种荧光信号强度的相对比值,如果某一染色体区域的检测DNA荧光强度信号明显增强,表明所检测的样本DNA相对于参照DNA序列发生增益,而参照DNA的荧光强度信号相对增强,则提示检
7、测DNA样本发生丢失。判断CGH质量的标准包括:(1)所有中期染色体具有平稳的高强度杂交;(2)在一个染色体的两个姐妹染色单体的绿/红荧光分布相似,一般正常的变异标准应小于0.851.15,而端着丝粒和异染色质区常超过这个范围,故一般不作分析;(3)染色体外周背景荧光水平低且一致;(4)染色体的端着丝粒和异染色质区连接的标记DNAs较低;(5)染色体呈现强烈的DAPI染色,可见的条带、足够的长度和微小的重叠。3CGH在肿瘤病理研究中的应用CGH已广泛应用于人体各种肿瘤的研究,晚近的资料表明,已对20000余例肿瘤的基因组热点重排、拷贝数目的异常、编码的基因、以及与肿瘤的发生发展、诊断、分类和预
8、后的关系进行了研究,这对于加深肿瘤分子生物学的理解具有重要意义3。3.1肿瘤染色体区DNA增益和丢失研究表明在许多恶性肿瘤如乳腺、卵巢、前列腺和肺癌染色体区1q、3q和8q常发生增益,而8p、13q、16q和17p常发生丢失。在睾丸癌发生12p和Xp增益,肾癌发生14q丢失,卵巢癌发生Xp丢失。这些特异位点的丢失反映了在癌发生过程中的独特性。为了评价恶性实体肿瘤遗传物质的增益和丢失,Mertens等6选择文献报告的11种肿瘤,根据508例乳腺癌、447例恶性神经性肿瘤、435例肾癌、333例结肠癌、304例卵巢癌、303例肺癌、209例睾丸生殖细胞肿瘤、206例头颈部癌、172例恶性黑色素瘤、
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 比较 基因组 杂交 原理
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【精****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【精****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。