比较基因组杂交原理.doc

1　CGH的基本原理
　　CGH是一种将消减杂交和FISH相结合，用于检测两个（或多个）基因组间相对DNA拷贝数变化（如扩增、增益（gains）、复制和丢失等），并将这些异常定位在染色体上，因此又称DNA拷贝数核型（DNA copy number karyotype）技术〔4〕。与传统的原位杂交方法相反，该法不是将单一的、已定的DNA探针杂交在受检的分裂中期或间期的细胞上，而以被检组织的基因组DNA为杂交检测样本，正常组织的DNA样本为参照，分别用不同颜色的荧光标记，两者按1∶1混合，与正常淋巴细胞中期染色体进行杂交（即反向原位杂交），再通过检测两种颜色的荧光强度，根据颜色的比例来显示基因组的结构状况。如果探针中某一染色体或染色体亚区呈现过度表达或低表达，则在正常染色体的相应区域内便呈现较强或较低的信号，表明该区域存在DNA序列的增益或丢失〔5〕。
　　2　CGH的基本方法
　　随着CGH技术的广泛应用，其操作方法已逐步完善，经验表明，CGH技术的建立和常规应用，对每一步操作都必须细致。CGH的主要步骤包括：（1）正常中期染色体的制备；（2）从肿瘤组织中分离高分子量的基因组DNA；（3）用不同的haptens标记正常和肿瘤DNA；（4）标记的DNA与正常中期染色体原位杂交；（5）荧光显微镜检查和数字化图像分析；（6）对中期染色体产生的绿红荧光密度比率相对应的拷贝数异常进行分析〔3～5〕。
　　2.1　正常中期染色体的制备　正常中期染色体充当CGH杂交的靶，CGH分析的质量主要依赖中期染色体的特性，中期染色体的制备采用常规PHT刺激和氨甲喋呤同步化处理的外周血淋巴细胞培养技术，一次应制备大量片子，以保证整个实验都使用同一批片子。此外，对制备的中期染色体玻片应选择重叠较少，形态保持较好，染色体较长的标本。
　　2.2　肿瘤标本的选择和基因组DNA的分离　分离DNA的标本应尽可能的选择具有典型肿瘤组织学特征和比例高的恶性细胞，弃除坏死组织和炎症区域及周边正常细胞，因其中含有坏死细胞降解的DNA和一些正常细胞，可显著消弱拷贝数改变的分辨能力。从肿瘤细胞和组织中提取高分子量DNA的方法均可用于CGH。福尔马林固定、石蜡包埋切片亦可获得相对高分子量的DNA，由于石蜡包埋组织提取的DNA浓度不足进行直接标记缺口平移法（nick translation），因此肿瘤DNA应用兼并引物PCR（degenerate oligonucleotide-primed PCR, DOP-PCR）扩增和标记，采用通用引物PCR（UN1-primer, 5’-CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG-3’， N=A，C，G或T）扩增和标记〔5〕。
　　2.3　正常和肿瘤DNA的标记　基因组DNA的标记可采用缺口平移法、随机引物法（random priming）和DOP-PCR等技术，通常采用生物素-14-dATP标记肿瘤DNA，地高辛-11-dUTP标记正常DNA，亦可用直接荧光素连接核苷酸，如FITC-dUTP和Texas Red-dUTP。与着丝粒和粘粒探针相比，缺口翻译法后的基因组探针片断长度范围在600～2000 bp，在缺口翻译反应中可通过调整DNase和DNA聚合酶的比例获得相应的DNA片断长度。

　　2.4　CGH杂交和染色　CGH杂交和染色基本遵循粘粒探针的染色体涂染和FISH技术，杂交中将一定比例不同标记的检测和参照DNA混合，并加入Cot-1 DNA以阻断重复序列对杂交结果的干扰，特别是近端着丝粒和异染色质区的比率改变。为了获得足够的DNA浓度，标记的DNA和阻断的DNA应充分混合。每次杂交前的变性时间和温度、蛋白酶K的量均不一样，应适应调整以达到最完全的变性和最佳探针穿透，但应避免破坏DAPI带型，一般在37℃湿度的小室中覆以盖玻片杂交2～4天，按照标准的FISH技术洗掉未结合的探针，如果用间接法标记探针时，用FITC（肿瘤DNA呈绿色荧光）和抗地高辛-罗丹明（正常DNA呈红色荧光）免疫组化染色。
　　2.5　荧光镜检和多彩数字图像分析　CGH分析主要依赖两种荧光素的相对强度，由多彩荧光显微镜和计算机多彩图像分析仪将荧光信号进行定量处理，评价沿染色体长轴分布的两种荧光信号强度的相对比值，如果某一染色体区域的检测DNA荧光强度信号明显增强，表明所检测的样本DNA相对于参照DNA序列发生增益，而参照DNA的荧光强度信号相对增强，则提示检测DNA样本发生丢失。判断CGH质量的标准包括：（1）所有中期染色体具有平稳的高强度杂交；（2）在一个染色体的两个姐妹染色单体的绿/红荧光分布相似，一般正常的变异标准应小于0.85～1.15，而端着丝粒和异染色质区常超过这个范围，故一般不作分析；（3）染色体外周背景荧光水平低且一致；（4）染色体的端着丝粒和异染色质区连接的标记DNAs较低；（5）染色体呈现强烈的DAPI染色，可见的条带、足够的长度和微小的重叠。
　　3　CGH在肿瘤病理研究中的应用
　　CGH已广泛应用于人体各种肿瘤的研究，晚近的资料表明，已对20000余例肿瘤的基因组热点重排、拷贝数目的异常、编码的基因、以及与肿瘤的发生发展、诊断、分类和预后的关系进行了研究，这对于加深肿瘤分子生物学的理解具有重要意义〔3〕。
　　3.1　肿瘤染色体区DNA增益和丢失　研究表明在许多恶性肿瘤如乳腺、卵巢、前列腺和肺癌染色体区1q、3q和8q常发生增益，而8p、13q、16q和17p常发生丢失。在睾丸癌发生12p和Xp增益，肾癌发生14q丢失，卵巢癌发生Xp丢失。这些特异位点的丢失反映了在癌发生过程中的独特性。为了评价恶性实体肿瘤遗传物质的增益和丢失，Mertens等〔6〕选择文献报告的11种肿瘤，根据508例乳腺癌、447例恶性神经性肿瘤、435例肾癌、333例结肠癌、304例卵巢癌、303例肺癌、209例睾丸生殖细胞肿瘤、206例头颈部癌、172例恶性黑色素瘤、142例Wilm瘤和126例成神经细胞瘤的细胞遗传学信息，对每一染色体的失衡进行计算，发现所有肿瘤的增益和丢失都有其独特的失衡分布，然而，不同类型的肿瘤也具有相当大的重叠，提示许多肿瘤的发生具有相似的分子机制，所有肿瘤的丢失程度明显高于增益，大多数肿瘤存在染色体X、Y、4、10、13～15、18和22以及染色体片断1p22-pter、3p13-pter、6q14-qter、8p、9p和11p的丢失。肺小细胞癌的染色体3q(85%)、5p(70%)、7p（70％）、7q（65％）和8q（65％）常发生信号增强，也见于1q、2p和20p；3q26、8q24、3q28-qter、7q11.2、8p11-12、12p12和19q13.1-13.2较常发生增益。而最常发生信号减弱的染色体是3p21, 8p21-pter、15q11.2-13、5q11.2-15、9p、13q12-14、17p和18q21-qter常发生丢失

〔7〕。
　　3.2　明确DNA增益和丢失的靶基因　CGH可精确定位肿瘤基因，特别是发生DNA增益的染色体位点。研究表明在一些肿瘤中存在多种染色体亚区增益或DNA拷贝数扩增。已发现乳腺癌高达30个染色体亚区参与增益和丢失，显著高于用癌基因特异DNA探针定位的结果。Morchio等〔8〕对50例伴HBV感染的进展期肝细胞癌（HCC）进行CGH，发现染色体臂4q(70%)和8p（65％）最常发生丢失，该丢失位于4q21和8p21-23的微小重叠区，以往研究发现在高分化HCC 4q21-22区完全丢失是一继发事件，其可增加已发生肿瘤的侵袭力，此区亦是HBV整合的部位；RFLP研究显示在8p21.3-22含有PRLTS基因（PDGF受体β样肿瘤抑制基因）。染色体臂16q(54%)、17p(51%)、13q(37％)、6q（37％）和1p36（30％）亦证实有丢失，在23％～85％的HCC发生含E-cadherin基因的16q21-24区丢失；染色体13q存在两个丢失区，分别含有RB1（13q14）和BRCA2（13q12）肿瘤抑制基因。染色体臂8q(60%)、1q(58%)、6p(33%)和17q(33%)频繁发生增益，最小重叠区定位于1q11-25和8q22-24，在许多肿瘤包括HCC频繁发生1p36的丢失，认为此区可能含有一个肿瘤抑制基因，1q的频繁扩增也提示存在一个癌基因参与癌的发生过程；此外在11q12、12p11、14q12和19q13.1也发现有扩增。对这些丢失或增益区分离克隆将可发现新的癌基因和肿瘤抑制基因。
　　3.3　肿瘤的分期与分级　Bockmuhl等〔9〕应用CGH对29例转移性（pN+）和19例非转移性（pNO）头颈部鳞形细胞癌研究发现，pNO肿瘤染色体5p、6p和7p过度表达，而pN+肿瘤频繁发生染色体7q、10q、11p、11q、15q和20p的丢失以及染色体19q和20q的过度表达，转移性癌的染色体10q25-q2611和p13-p14的丢失显著增高，微卫星多态物杂合性分析亦证实染色体10q的异常，表明这种独特的遗传学改变与头颈部鳞形细胞癌的转移表型有关。Weber等〔10〕应用CGH对19例良性（WHOⅠ级，MⅠ）、21例不典型（WHOⅡ级，MⅡ）和19例间变型（WHOⅢ级，MⅢ）散发的脑膜瘤染色体失衡扫描发现，随着恶性程度的增加，染色体遗传学异常明显增多，每个肿瘤总的数目改变分别为2.9±0.7、9.2±1.2和13.3±1.9，在MⅠ最常发生的改变是22q丢失；在MⅡ肿瘤组织的1p（76％）、22q(71%)、14q(43%)、18q(43%)、10q(33%)和6q（33％）常发生丢失，20q（48％）、12q（43％）、15q（43％）、1q（33％）、9q（33％）和17q（33％）常发生增益；在MⅢ肿瘤组织除与MⅡ相似的发生频率外，6q（53％）、10q（68％）和14q（63％）的丢失频率增加，9p的丢失为32％，4/16（25％）的MⅢ肿瘤组织发现在9p21位点CDKN2A的纯合性丢失，1例MⅡ和8例MⅢ肿瘤组织存在17q23的DNA序列扩增，尽管所有Ⅱ、Ⅲ级肿瘤组织存在高频率的染色体异常，均无1例发生TP 53外显子5～8的突变，推测肿瘤基因组的异常可能与脑膜瘤的进程有关。

　　3.4　肿瘤的诊断与鉴别诊断　Petersen等〔11〕应用CGH对25例肺鳞形细胞癌和25例肺腺癌的染色体失衡研究发现，染色体1p、3p、4q、5q、6q、8p、9p、13q、18q和21q常发生DNA拷贝数目的减少，5p、8q、9p、11q13、16p、17q和19q发生DNA增益，在腺癌染色体1q过度表达和3q、9q、10p和19DNA丢失更常见，而鳞形细胞癌染色体3q、12p的过度表达和2q的丢失增加，两种组织学类型之间存在明显差异，染色体带1q23的过度表达和9q22的丢失与腺癌密切相关，而染色体带2q36-37的DNA丢失及3q21-22和3q21-qter的过度表达是鳞形细胞类型的重要标记。
　　3.5　肿瘤预后与治疗中的应用　Sallinen等〔12〕应用CGH对11例Ⅱ级星形细胞瘤（其中预后好者7例，预后差者4例）和13例Ⅲ～Ⅳ级星形细胞瘤分析发现，预后好的肿瘤染色体异常的中位数是2（0～4），染色体改变以X（5/7）、1p32-pter（2/7）和7q(2/7)增益为主，仅1例发生染色体（16pter-q22, 22q）丢失；预后差的肿瘤染色体异常的中位数是15.5（8～28），染色体1p22-q21(3/4)、2q(3/4)、3p13-q13(3/4)、4q(3/4)、5p(3/4)、9p(3/4)、13q(3/4)、18q(3/4)、10q(2/4)、12q(2/4)和14q(2/4)发生丢失，染色体1p34-pter(3/4)、11q13(3/4)、X(3/4)、8q21(2/4)、11q23-q24(2/4)、12q24(2/4)、15q23(2/4)和19q(2/4)以增益为主，预后差的Ⅱ级星形细胞瘤的丢失与Ⅲ～Ⅳ级和肿瘤细胞系相似，表明Ⅱ级星形细胞瘤遗传学改变的早期积聚与病人的差预后密切相关。

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