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流动相的调节.doc
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1、流动相的调节是搞液相分析最重要的环节,也是液相水平高低的度量,每一种液相都有影响它的主要因素,抓住主要因素,问题就容易解决。欢迎大家讨论。一则可以为新手传播知识,二则大家相互学习共同提高!先开个头:常用的是化学键合相色谱,分离中性化合较简单,主要是调节溶剂强度,可从有机相的比例合种类两个方面入手,例如:有机相占的比例大,出峰就早。 分离酸碱化合物就就复杂一点,增加了添加剂,明白了添加剂的作用,然后从溶剂,酸碱性,添加剂等方面入手,问题就容易解决。液相色谱采用键合硅胶可以分离绝大多数的分析物质,针对不同化学性质的单体采用不同的键合硅胶,现在有什么十八烷、氨基柱、氰基、苯基太多了,再加上不同流动相
2、也就是加入不同的抑制剂可以测许多成分,比如:酸性的可以用十八烷加入酸,加缓冲盐;碱性物质可以加缓冲盐。以个人来讲用离子对的形式较多,并且效果也很好。现在分析生物碱是比较难做的。如用反相色谱柱时,一般先改变有机相与水相的比例;再考虑改变pH值,酸性物质将pH值调低,碱性物质将pH值调高;如两者都无效,可考虑加入离子对试剂,如庚烷磺酸钠用于(碱性药物)一 反相HPLC中的溶剂优化:1.首先应调整k值:强溶剂20递减选择合适的溶液强度,使得k在120(tR:335min)。 一种方法是首先试用一种可能过强的流动相,在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k。当所有谱峰符合1k20的范围时,从溶剂强度的观
3、点来说,其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度)。(反相色谱溶剂极性弱洗脱能力强,组分k减小)。另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验,有可能估计出使样品的k值符合1k20范围的大概溶剂成分。2.改变选择性():根据分子间作用力将溶剂分组。不同组的溶剂选择性不同,根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性。二 离子对HPLC中的溶剂优化: 离子对色谱法是分离离子,或可电离的分子的一种色谱技术。关于离子对色谱的机理,至今仍不十分明确,但己提出三种机理:离子对形成机理,离子交换机理,离子相互作用机理。在以下讨论中,采用离子对形成机理。 基本原理:有一色谱体系,固定相为非极性,如C18型键
4、合相,流动相为水溶液,并在其中加入一种电荷与组分离子相反的离子B+,B+离子由于静电引力,与带负电的组分离子生成离子对,故称它为平衡离子或成对离子。由于离子对具有疏水性,因而被非极性固定相(即有机相)提取。组分离子的性质不同,它与平衡离子形成离子对的能力大小不同,以及离子对的极性不同,导致各组分离子在固定相中滞留的时间不同,因而各离子先后离开色谱柱,这就是离子对色谱法的基本原理。以上这类色谱法称反相离子对色谱法。能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品,如碱类、酸类、离子、以及带有可离解的多种官能团化合物的分离。可用于生理体液的分析,如甾族化合物以及体液中药物的分析。反相离子对色
5、谱中流动相的影响小结 :1.改变选择性:a.改变溶剂种类: 改变溶剂选择性的方法,类似于键合相色谱所介绍的原则。选用不同选择性组别的溶剂,可使流动相的选择性得到明显改进。b.改变pH: 组分离子与平衡离子的生成,离子对的形成,都与流动相的pH值密切相关。改变流动相的pH可以改变体系的选择性。流动相的pH值应调节到能使不同组分有合适的离解度,而使提供平衡离子的化合物能完全离解。要符合这一要求,只有使提供平衡离子的化合物在一个很宽的pH范围内保持完全离解,因此,只有强酸盐(高氯酸盐或烷基磺酸盐)和强碱盐(季铵盐)才满足此要求。c.系统选择:使用一种有机溶剂(甲醇);流动相的其它三种成分为pH=2.
6、5,pH=7.5的缓冲液以及另一种pH=5.5、其中含有最大浓度(例如:200mM)的离子对试剂的缓冲液(D)。以组合不一的缓冲液(BD)进行七次实验,并变化甲醇(A)量以保持每次实验的k值范围大致恒定。三 正相HPLC中的溶剂优化溶剂非极性溶剂:正己烷或FC-113(1,1,2-三氟-1,1,2-三氯乙烷)极性溶剂:非定位、碱性定位和非碱性定位按正相HPLC中谱峰间距效应分类的溶剂取代和定位是正相HPLC流动相选择性的主要来源溶剂强度调节选择性影响四、梯度洗脱梯度洗脱给色谱分离带来很大的方使,已成为高效液相色谱法不可缺少的部分。所谓梯度洗脱,就是有两种(或两种以上)不同极性的溶剂,在分离过程
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