荧光共振能量转移.doc
《荧光共振能量转移.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《荧光共振能量转移.doc(5页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、 . FRET技术研究PEDF和目标蛋白之间在小鼠神经元(神经胶质细胞)的相互作用一、FRET技术基本原理荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共振转移)。FRET是一种非辐射能量跃迁,通过分子间的电偶极相互作用,将供体激发态能量转移到受体激发态的过程,使供体荧光强度降低,而受体可以发射更强于本身的特征荧光(敏化荧光),也可以不发荧光(荧光猝灭),同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与
2、受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对,荧光物质必须满足以下条件:受、供体的激发光要足够分得开;供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上,成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。(传统有机荧光染料吸收光谱窄,发射光谱常常伴有拖尾,这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度,而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究,克服了有机荧光染料的不足之处。相对于传统有机荧光染料分子,量子点的发射光谱很窄而且不拖
3、尾,减少了供体与受体发射光谱的重叠,避免了相互间的干扰;由于量子点具有较宽的光谱激发范围,当它作为能量供体时,可以更自由地选择激发波长,可以最大限度地避免对能量受体的直接激发;通过改变量子点的组成或尺寸,可以使其发射可见光区任一波长的光,也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体,并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠,增加了共振能量转移效率。)以GFP的两个突变体CFP(cyan fluorescent protein)、YFP(yellow fluorescent protein)为例简要说明其原理:CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠,当它们足够接近时,用C
4、FP的吸收波长激发,CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上,所以CFP的发射荧光将减弱或消失,主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比,对空间位置的改变非常灵敏。例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用,可以根据FRET原理构建融合蛋白,这种融合蛋白由三部分组成:CFP(cyan fluorescent protein)、蛋白质b、YFP(yellow fluorescent protein)。用CFP吸收波长433nm作为激发波长,实验灵巧设计,使当蛋白质a与b没有发生相互作用时,CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能
5、量转移,因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光;但当蛋白质a与b发生相互作用时,由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化,使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移,此时检测到的就是YFP的发射波长为527nm的荧光。将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达,这样就可以在活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间的相互作用。黄色荧光蛋白报告载体,如下图:青色荧光蛋白报告载体,如下图:一质粒的选择及载体构建:订购:1.带有Sal I和Sac II两个酶切位点的小鼠PEDF过表达克隆质粒2.带有Kpn I和Xba I两个酶切位点的小鼠目标蛋白过表达克隆质粒3.pECFPC1质粒
6、4.pEYFPC1质粒5. Sal I、Sac II、Kpn I、Xba I内切酶6.dna合成酶等二 PEDF核青色荧光蛋白(pECFP-C1)表达载体的构建及鉴定小鼠c57PEDF序列blst获得:1 atgcaggccc tggtgctact cctctggact ggagccctgc tcgggcacgg cagcagccag61 aacgtcccca gcagctctga gggctcccca gtcccggaca gcacgggcga gcccgtggag121 gaggaggacc ccttcttcaa ggtccctgtg aacaagctgg cagcagctgt ctcca
7、acttc181 ggctacgatc tgtaccgcct gagatccagt gccagcccaa cgggcaacgt cctgctgtct241 ccactcagcg tggccacggc cctctctgcc ctttctctgg gagctgaaca tcgaacagag301 tctgtcattc accgggctct ctactacgac ctgatcacca accctgacat ccacagcacc361 tacaaggagc tccttgcctc tgttactgcc cctgagaaga acctcaagag tgcttccaga421 attgtgtttg agag
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 荧光 共振 能量 转移
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【人****来】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【人****来】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。