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电镜与样品制备技术支持

电镜样品取材方法
1　动物及人体组织的取材
动物组织的取材，应在麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1㎜宽，2～3㎜长的小块，从中挑选损伤小的小条，再将其切成１㎜3的小块，最后用牙签将这些小块逐个放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固定（０～４℃）。
2　体外培养细胞的取材
生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒出培养液，接着到入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置３～５min，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将具有细胞的固定液转移到离心管中，普通离心机低速离心（2023转/分钟）15min，使细胞聚成团块，弃去上清夜，换上新鲜固定液继续固定。
3 植物组织的取材
植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不象动物细胞那样迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗透。因此，植物材料的取材宜切成薄片状，经适当固定后再切成小方块。

电镜样品取材的基本规定
⑴　快　取材的动作要迅速，最佳在材料离体后１min内就进入固定液；解剖器械要锋利，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤。
⑵　准　取材要准确。①　器官要准确　②　部位要准确：如脑垂体的前叶和后叶要分清，其结构和功能各不相同。
⑶　冷　取材过程应尽量在低温下进行（０～４℃），以减少酶的活性，减少细胞内结构的损失。
⑷　小　所取材料体积要小，一般不超过１㎜3。由于固定剂的渗透力较弱，若组织块太大，块的内部将得不到良好的固定。

电镜制样中常用固定剂的配制方法
⑴　缓冲液的配制
Ａ、磷酸缓冲液（0.2M）的配制方法如下：
甲液：Na2HPO4.12H2O 　　71.64g
　　　加蒸馏水溶解成 　1000ml
乙液：NaH2PO4.2H2O 　　31.21g
　　　加蒸馏水溶解成 　1000ml
按下表混合甲、乙两液即得所需PH的磷酸缓冲液
表1：0.2M的磷酸缓冲液的配制（50ml）
　PH 　　　6.4 　6.6 6.8 7.0 　7.2 7.4
甲液（ml） 13.3 18.8 24.5 30.5 36.0 40.5
乙液（ml） 36.7 31.2 25.5 19.5 14.0 9.5
磷酸盐缓冲液对细胞无毒性作用，常用于配制戊二醛固定液，并适于作灌注固定。本缓冲液的缺陷是固定期容易产生沉淀，并容易生长细菌，不能长期储存。
B、 二甲胂酸盐缓冲液（0.2M）
甲液：二甲胂酸钠 4.28g
加蒸馏水至 100ml
乙液：0.2N盐酸
按表2混合甲、乙两液后，将总体积稀释成200ml即可获得不同PH的缓冲液
表2：二甲胂酸钠缓冲液的配制
　　PH 　 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4
甲液（ml） 50 50 50 50 50 50
乙液（ml） 18.3 13.3 9.3 6.3 4.2 2.7
本缓冲液比较稳定，不易生长细菌，可长期保存，与低浓度的钙质（1-3mM）不发生沉淀反映。缺陷是胂有毒性、有臭味，配制时应在通风橱中进行。
⑵ 常用固定液的配制
A、0.1M磷酸缓冲戊二醛固定液（市售戊二醛多为25%的水溶液）
表3：0.1M磷酸缓冲戊二醛的配制
戊二醛最终浓度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0
0.2M磷酸缓冲液（ml）50 50 50 50 50 50 50
25%戊二醛水溶液（ml）4 6 8 10 12 16 20
双蒸水加至（ml） 100 100 100 100 100 100 100
B、0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液
表4：0.1M二甲胂酸钠缓冲戊二醛固定液的配制
戊二醛最终浓度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
0.2M二甲胂酸钠缓冲液（ml） 50 50 50 50 50
25%戊二醛水溶液（ml）　　　4 6 8 10 12
双蒸水加至（ml） 　　　100 100 100 100 100
C、多聚甲醛-戊二醛固定液
取2克多聚甲醛粉末溶于25毫升蒸馏水，65℃下不断搅拌，加1-3滴1N氢氧化钠，使溶液透明，冷却后加5毫升5%戊二醛，加二甲胂酸缓冲液或磷酸缓冲液（0.2M，pH7.2-7.6）使总体积到50毫升，并加25毫克无水氯化钙。混合液的pH为7.2。本液对微管有良好的保存作用。

透射电镜的成像原理　
目前，主流的透射电镜镜筒是电子枪室和由6～8级成像透镜以及观测室等组成。阴极灯丝在灯丝加热电流作用下发射电子束，该电子束在阳极加速高压的加速下向下高速运动，通过第一聚光镜和第二聚光镜的会聚作用使电子束聚焦在样品上，透过样品的电子束再通过物镜、第一中间镜、第二中间镜和投影镜四级放大后在荧光屏上成像。电镜总的放大倍数是这四级放大透镜各级放大倍数的乘机，因此透射电镜有着更高的放大范围（200×～1000000×）。　　

透射电镜的一般操作流程
接通电镜工作电源后，电镜开始通过机械泵抽前级和镜筒真空，当镜筒真空达成一定规定期，再由扩散泵抽镜筒的高真空，当高真空能达成加高压的规定期，面板上高真空指示灯点亮，表白此时可以加高压了，接通高压并调整高压到合适的高压值，稍等一会待高压稳定后，再增长灯丝电流，使荧光屏中心产生一个明亮的光斑，随后依次接通各级透镜的工作电流，调整电镜的工作状态，调整好后再加入样品进行观测，并对感爱好的部位拍照记录。电镜使用完毕，应依次关闭高压、灯丝加热电流、关闭各级透镜工作电流以及取出样品。待冷却水再工作10～15min后，关闭电镜和冷却水。

电镜在生物医学领域中的应用
17世纪光学显微镜的发明，促进了细胞学的发展，20世纪电子显微镜的发明，揭开了病毒和细胞亚显微结构的奥妙。在20世纪60年代以来，电镜广泛应用于工农业生产、材料学、考古学、生物学、组织学、病毒学、病理学和分子生物学等众多研究领域中。但电镜技术从应用的广度、研究的深度等方面看，没有哪一个领域可与生物医学相媲美。
1 在细胞学方面：由于超薄切片技术的出现和发展，人类运用电镜对细胞进行了更进一步的研究，观测到了过去无法看清楚的细胞超微结构。例如，用电镜观测到了生物膜的三层结构以及细胞内的各种细胞器的形态学结构等。
2 电镜在发现和辨认病毒方面起到了重要作用：许多病毒，特别是肿瘤病毒就是用电镜发现的。电镜也为病毒的分类提供了最直观的依据，例如去年肆虐全球的SARS病毒就是一方面在电镜下观测到并确认是病毒而不是支原体的。
3 在临床病理诊断方面：生物体发生疾病都会导致细胞发生形态和功能上的改变，通过对病变区细胞的电镜观测就可认为疾病诊断提供有力依据。例如目前电镜在肾活检、肿瘤诊治中发挥了重要作用。

4 电镜技术与生命科学中新兴起的技术相结合，促进了新技术的应用。例如电镜技术与免疫学技术相结合产生了免疫电镜技术，它可以对细胞表面及细胞内部的抗原进行定位，可以了解抗体合成过程中免疫球蛋白的分布情况等。

透射电镜在生物医学研究中的重要技术
1 常规超薄切片技术
一般的透射电镜电子束的穿透能力较弱，大多数标本无法直接在电镜下观测，必须切成厚度为50~70nm的超薄片，这种制作超薄片的技术称为超薄切片技术。在透射电镜的生物医学样品制备方法中，超薄切片技术是最基本最常用的制备技术，其他一些样品制备技术，如细胞化学技术，免疫电镜技术及电镜放射自显影技术都离不开超薄切片的制作。运用透射电镜观测超薄切片，可以了解细胞的精细结构。　
2 负染色技术

负染色技术也叫阴性反差染色，它是由Hall等一方面采用的一种染色技术，与超薄切片法相比，该技术具有分辨率高、简朴易行和快速方便等优点。因此在生物学研究中广泛应用。这种方法可以显示大分子、细菌、病毒、原生动物、分离的细胞器及蛋白质晶体等样品的形状、大小和表面结构特性。特别是在病毒学领域，有关病毒的分类及病毒亚单位结构的显示、病毒与抗体的互相作用等的研究中，负染色更是不可缺少的实验技术。
3 金属投影与复型技术

金属投影技术是运用真空喷镀仪对样品进行投影的一种技术，Williams一方面用这种技术用于增长电镜图象的反差。该技术还可用来测量颗粒及大分子的大小。复型技术重要用于样品表面结构的研究。某些坚硬的材料，如牙齿、骨骼、金属等，它们是不透明的，并且很难制成超薄切片，对于这些材料可用一种电子透明的薄膜将其表面结构复制下来，即成复型。通过对该复型样品的观测，就可以了解原有样品的天然断面或人工断面的结构特性。
4 冷冻切片技术和冷冻蚀刻复型技术
冷冻切片技术是使样品迅速冷却，然后用冷冻切片机进行冷冻切片，它省去了普通超薄切片中繁杂的化学固定与包埋操作。该技术在细胞化学研究中有着特殊用途。冷冻蚀刻复型技术是一种冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术，该技术在生物学中的广泛应用不仅验证了超薄切片所展示的细胞超微结构，并且还揭示了某些前所未见的新结构，特别是在显示生物膜的结构方面，该技术有着独特作用。

5 电镜细胞化学技术
电镜细胞化学技术又称超微结构细胞化学技术，它是从光镜组织化学的基础上发展起来的一种超微结构技术，它的任务是研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的化学和生化功能。其中最重要的是蛋白质（特别是酶的细胞内定位），另一方面是核酸、脂肪、碳水化合物及无机离子的定位。该技术有利的促进了形态学和生物化学的结合，使生命科学的研究进入了新的水平。
6 免疫电镜技术
免疫电镜技术是通过特殊的标记方法使抗体与电子致密的标记物相结合，然后运用电镜在超微微结构水平上鉴定抗原-抗体的结合反映。在免疫学领域中，这是一种非常有用的实验技术。
7 电镜放射自显影技术
电镜放射自显影技术是一种运用放射性同位素作为标记物对细胞化学物质进行超显微结构的定位、定性或定量研究的技术。这种技术不仅用于对重要的代谢物质进行定位、定性或定量，并且还用于显示抗原-抗体的结合，激素或药物与受体的结合，显示病毒的感染与复制部位等。因此这是一种非常有用的现代生物学技术。

体金标记免疫电镜

包埋前胶体金标记免疫电镜
胶体金探针（>3nm）即使在使用穿透剂的情况下也不易穿透细胞，因此经常用于细胞表面抗原的标记。20世纪90年代，国外成功制备了1nm金标记的探针，这种探针容易穿透组织和细胞，已成功应用于标记细胞内抗原。包埋前免疫标记时，在标本未作固定或轻微固定后进行免疫标记，标记后再用2％戊二醛+2％多聚甲醛固定以获得较好的超微结构保存。这种方法特别合用于标记对固定剂敏感的抗原。在标记细胞膜表面成分时，应注意免疫标记也许会引起细胞膜成分的重分布，抗体与未固定或轻微固定的细胞膜成分的结合也许会引起这些分子的聚集、成帽或内吞。通常用含低浓度戊二醛的固定液作短暂固定，能有效防止膜分子的重分布。单独用多聚甲醛固定或在4℃做免疫标记局限性以防止质膜分子向周边扩散。

细胞表面抗原标记（间接法）

•细胞用PBS洗两次，用0.5％戊二醛+2％多聚甲醛在室温下固定0.5～lh。可根据抗原对固定剂的敏感度选择恰当的固定液，对某些抗原可完全不用戊二醛，用4％多聚甲醛固定1～4h。
•用PBS漂洗3～5次，每次20 min。
• 用0.1 mol/L甘氨酸漂洗细胞5min，灭活自由醛基。这一环节对用戊二醛固定的细胞尤为重要，由于戊二醛具有两个醛基，在固定期其中的一个醛基也许与细胞成分结合，而留下一个自由的醛基，若这个自由的醛基不被阻断，则能与阻断液中的蛋白或抗体结合，从而增长非特异性背景染色。
•用含1％BSA的无钙镁Dulbecco's PBS漂洗细胞15min，以阻断对一抗的非特异性结合。阻断液可以是2％～10％BSA，也可以是卵蛋白（OVA）、正常血清或IgG片段。
•室温下用适当稀释的第一抗体孵育细胞1～2h，用无钙镁Dulbecco's PBS漂洗细胞5次，每次5min，以除去未结合的一抗。假如非特异性染色背景很高，可在漂洗液中加入0.1mol/L EDTA。
•室温下用适当稀释的胶体金探针（可以选择二抗-胶体金、蛋白A-胶体金或蛋白G-胶体金）孵育细胞30min。
•用无钙镁Dulbecco's PBS漂洗细胞5次，每次5 min。
•室温下用2％戊二醛+2％多聚甲醛（用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液配制，pH7.4）再次固定细胞1 h。
•用0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液漂洗，1％锇酸后固定，常规脱水包埋，超薄切片铀铅染色后透射电镜下观测。也可按常规扫描样品制备方法解决，在扫描电镜下观测细胞表面的胶体金标记情况，由于扫描电镜分辨率的限制，应选用40nm以上的胶体金或采用银加强染色法。
•对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。

细胞表面抗原标记（直接法）

•按间接法前4步操作。
•室温下用适当稀释的第一抗体-胶体金复合物孵育细胞lh。 •按间接法环节7～10操作。

纳金（超微金）-银加强法标记细胞内抗原（0chs等，1994年）

•将单个盖玻片放人直径为35mm的皮氏培养皿中，加入3ml培养液。
•培养2～3d后，用PBS洗单层细胞，然后用3％的甲醛（由对甲醛新配制而成）室温下固定30min，用PBS（pH7.4）缓冲液改变戊二醛的含量（0.01％～0.5％）。
•用来检查每种抗原的戊二醛浓度并不相同，但戊二醛浓度越高，固定效果越好。应有一份不加戊二醛的样本作为阳性对照，由于大多数抗原都能被戊二醛固定。固定期溶液的pH值应与细胞生长时的pH值同样。
•用PBS洗细胞三次，每次10min，用35mmol／L的甘氨酸或1mg／ml的NaBH4/PBS液猝灭三次，每次5min。
•室温下用0.2％的TritonX-100/PBS液渗透细胞5min。
•用PBS洗细胞3次，每次5min。
•室温下用1％的正常羊血清(NGS)/PBS液（NGS/PBS）封闭细胞30min。
•用在1％NGS/PBS稀释下的一抗孵育细胞，室温下1h或4℃过夜。
•PBS洗细胞3次，每次5min。
•用1％的NGS/PBS封闭细胞30min。
•用与抗人、抗鼠或抗兔Fab共价相连的1.4nm超微金颗粒在1％，NGS/PBS中稀释成1/100，室温下摇动哺育细胞1h。
•PBS洗细胞3次，每次5min。
•用l％的戊二醛/PBS固定细胞30min。
•用PBS洗3次，每次5min。
•用双蒸水洗3次，每次5min。
•室温下避光用HQ银[根据厂商说明（Nanophobes）]进行银增强， 3～4min，时间越长，银包被的金颗粒就越大。
•水洗3次，每次5min，终止银反映。
•用1％的OsO4的二甲胂酸盐缓冲液，pH7.3，固定样本30min。
•用水洗样本3次，每次5min。
•用乙醇脱水，Epon 812包埋。
•检查由柠檬酸铅和醋酸铀染色的或未染色的薄切片。
•金颗粒标记可以通过EM底片进行定量分析，分析结果可表达为“金颗粒数/μm2”。

包埋后胶体金标记免疫电镜
包埋后免疫胶体金标记是应用最广泛的免疫电镜技术，标本经固定、包埋、切片后在超薄切片上进行免疫标记。包埋后免疫胶体金标记也可分为直接法和间接法两种：

直接法是用与胶体金交联的第一抗体直接进行标记；间接法是用不带标记物的第一抗体先与组织反映，然后用胶体金标记的第二抗体或第三抗体、蛋白A或蛋白G等特异性结合第一抗体，因此只要制备一种胶体金探针就能用于许多抗原的标记，方法更为简便，且敏感性比直接法高。蛋白A和蛋白G的胶体金探针是包埋后免疫胶体金标记中应用最广的第二试剂，它们对不同种抗体的亲和力，可根据一抗的种类选择合适的胶体金探针。抗体-胶体金探针也较常用，但其稳定性不如蛋白A-胶体金探针。此外，胶体金标记的亲和素（avidin）、凝集素（1ectins）以及酶也曾被应用于包埋后标记。

标准方法

•标本用固定液在室温或4℃下固定1～6 h。
•标本用PBS漂洗3次，每次10 min。
•用0.1 mol/L甘氨酸漂洗标本20～30min，封闭残留的自由醛基。
•用PBS漂洗标本3次，每次10 min。
•低温脱水：4℃，30％乙醇脱水10min；4℃，50％乙醇脱水30min；-20℃，70％乙醇脱水1h；-35℃，90％乙醇脱水1h；-35℃，100％乙醇脱水1h。
•低温渗透：-35℃，以1：1和1：2的无水乙醇：低温包埋剂（LRWhite，LR Gold，Lowicryl）各渗透1h；纯低温包埋剂渗透1h；纯低温包埋剂渗透过夜。
•包埋、聚合：明胶胶囊作包埋模具，紫外灯聚合箱内，用365nm紫外灯进行光聚合，在-35℃下聚合1～2天，转入室温再聚合2～3天。
•超薄切片：切片的厚度较一般的略为厚一点（切片的光干涉色呈淡金黄色），将切片捞在镍网上。
• 蚀刻（此步可省略）：用于蚀刻的溶液有三种：饱和过碘酸钠水溶液、1％ H2O2、乙醇盐，目的是暴露切片内部的抗原、使试剂能穿透标本，但此步解决常会使超微结构受到破坏，且会影响抗原性。若非必要，一般不作蚀刻。蚀刻的作法是，在parafilm或蜡片上滴一滴用于蚀刻的液体，然后将带有切片的镍网轻轻漂浮在液滴上（有切片的一面向下）。蚀刻后直至免疫标记完毕，镍网应始终保持湿润状态，否则易出现难以清洗的非特异性反映。
•用去离子双蒸水漂洗切片3～5次。
•切片用1％BSA或5％正常血清（无钙镁Dulbecco's PBS或TBS配制）孵育15～30min以阻断对第一抗体的非特异性结合。Brorson SH建议用5％BSA孵育1h以去除非特异性标记，BSA的浓度过高或孵育时间过长也许会使标记率下降。
•用适当稀释的第一抗体室温孵育l～2h。一抗用含0.1％BSA的无钙镁Dulbecco's PBS或TBS稀释。
•用无钙镁Dulbecco's PBS或TBS漂洗切片6次。
•室温下用适当稀释的胶体金探针（可以选择二抗-胶体金、SPA-胶体金或蛋白G-胶体金）孵育30～60min。
•漂洗同上环节。
•用去离子双蒸水冲洗切片。
•用醋酸铀和硝酸铅染色后在透射电镜下观测。
•对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。

链霉亲和素-胶体金法

生物素-亲和素（biotin-avidin）检测系统已被广泛应用于免疫细胞化学和分子生物学。该系统运用生物素与亲和素之间的高度亲和力（解离常数：10-15）而建立的。亲和素会与许多组织非特异性结合，这重要是由于它是一种糖基化的蛋白，并且具有很高的等电点（pI=10）。由于亲和素的非特异性结合问题，目前亲和素已基本被链霉亲和素(streptavidin)所代替。链霉亲和素具有同亲和素类似的特性，但没有糖基化，几乎没有非特异性结合。链霉亲和素-胶体金检测系统常在包埋后免疫细胞化学中应用，这个系统经常由不作标记的一抗、生物素化的二抗和链霉亲和素-胶体金组成，也可不用二抗，直接使用生物素化的一抗和链霉亲和素-胶体金。该系统所需的试剂都已商品化，可以从试剂公司购买得到。

•按以上标准方法中的前12步操作。
•室温下，用适当稀释的二抗-生物素孵育切片30min。
•用无钙镁Dulbecco's PBS或TBS冲洗切片5次。
•室温下用适当稀释的链霉亲和素-胶体金探针孵育30min。
•用无钙镁Dulbecco's PBS或TBS冲洗切片5次。
•醋酸铀、枸缘酸铅染色后在透射电镜下观测结果。
•对照组可省略一抗或用正常血清、正常IgG、无关抗体代替一抗。

双重或多重免疫标记法

由于在制备过程中胶体金颗粒的直径可以控制，因此就可以运用不同大小的胶体金颗粒做双重免疫标记甚至三重免疫标记。做双重免疫标记时，一般选择5nm和15nm胶体金，在透射电镜下很容易区分这两种胶体金。做三重免疫标记时，则选择5nm、10 nm和15nm胶体金。应使用经蔗糖梯度离心纯化得到的大小均一的胶体金探针。双重或多重免疫标记有多种方法，如直接法、间接法、双面双重标记法等。间接法必须在第一种抗原被标记完毕后用甲醛蒸气阻断也许存在的游离的第一抗体结合位点，阻断的时间必须控制好，时间太短则会导致交叉免疫反映，太长则会影响后一种抗原的标记率。双面双重标记法在操作时必须非常小心，不能弄混标记面，且不能将抗体沾到另一面，否则会影响结果的准确性。鉴于以上因素，推荐采用直接法进行双重标记，标记效果好，对阳性结果容易做出对的的判断和分析。直接法是将针对两种或三种抗原的抗体分别与不同直径的胶体金结合，然后直接进行免疫标记。免疫标记时先将切片与一种抗体-胶体金孵育，用TBS漂洗后再与另一种抗体-胶体金孵育，其他环节同包埋后免疫胶体金单标记法。

酶标记免疫电镜

组织抗原的包埋前免疫酶标记

•固定：免疫电镜通常采用4％多聚甲醛和低浓度的戊二醛（0.1％～0.5％）混合液灌注固定。PBS充足洗涤。
•预切片：用振动切片机将样品切成40～60μm的厚片。
•正常山羊血清（1：20）室温30 min。
•加入适当稀释的第一抗体，置冰箱（4℃）内24h。PBS充足洗涤。
•正常山羊血清（1：20）室温30 min。
•加入稀释好的HRP标记的第二抗体。室温1h。PBS充足洗涤。
•2.5％戊二醛后固定15～30min。PBS充足洗涤。
•0.75mg/ml的DAB溶液，室温避光反映15min。
•加等量DAB溶液，内含0.02％H2O2（加入后最终浓度为0.01％），室温避光反映15～20min。PBS充足洗涤。
•在解剖显微镜下观测免疫反映阳性部位并取下。
•用1％锇酸（pH 7.4）后固定0.5～1h。PBS充足洗涤。
•梯度乙醇或丙酮脱水。
•环氧树脂包埋。
•超薄切片，铀、铅染色或单染或不染。 •电镜观测。

组织抗原的包埋后免疫酶标记

•新鲜组织经固定后（勿用OsO4后固定），低温下进行梯度乙醇脱水，用低温包埋剂进行包埋、光聚合，超薄切片（用镍网捞片）。
•正常山羊血清（1：20，用pH 7.6的0.02mol/L TBS稀释）室温孵育5～15 min。
•加入适当稀释的第一抗体（兔抗血清）（用含1％正常山羊血清的0.02mol/LTBS）4℃孵育过夜，然后用TBS漂洗。
•山羊抗免IgG（稀释液同一抗）室温30～60min，然后用TBS洗涤。
•兔PAP复合物（稀释液同一抗）室温30min后用TBS洗涤。
•DAB－4HCl/$H_2O$（0.0125％/0.0025％）室温15min后用TBS洗。
•1％ OsO4固定10～15min。水洗后用醋酸铀单染或不染。
•电镜观测。

对照实验：
•吸取实验：将足量的抗原如P物质加入抗P物质的抗血清内，离心取其上清液，用这样的血清代替一抗，结果应为阴性。
•替换实验：用正常血清为第一抗体，结果为阴性。

冷冻超薄切片免疫电镜

在包埋前免疫标记中要用化学的或物理的方法增长膜的通透性，在包埋后免疫标记条件下，又需经化学剂脱水、包埋剂渗透聚合后再进行免疫标记，这样解决都也许对蛋白质的抗原性带来危害。采用免疫冷冻超薄切片技术可以避免这些缺陷，显示上述方法所不能显示的抗原。冷冻超薄切片是用冰冻的、通过固定但未经包埋的组织切成的，在免疫标记后再将切片加以包埋，以防止切片干燥收缩引起的结构改变。该方法进行的顺序是固定、蔗糖浸泡、切片、切片收集、免疫标记和重金属染色。

在切冷冻超薄切片之前，最佳先用冷冻半薄切片做免疫荧光标记以拟定阳性部位。由于戊二醛能发射荧光，故凡经戊二醛固定的标本，在免疫标记前需用NaBH4阻断此作用。

冷冻超薄切片免疫标记的重要环节。为叙述方便，抗原、抗体、蛋白质A和金颗粒分别用AG、AB、PA和g来表达。

单标记

最先进行的"阻断"或"检查"环节是为了减弱非特异标记。一般来说，在冷冻切片中减少非特异性标记比塑料切片中容易。各种不同的蛋白质如牛血清白蛋白或明胶，已经成功地用于这个目的。最近，l％～5％的小牛或山羊血清或鱼皮明胶也被广泛应用。这里描述的免疫标记环节使用的试剂是0.5％BSA。通常，所有的免疫标记和重金属染色环节均在石蜡封口膜（Parafilm）上进行。

•将载网浮在0.5～l ml含0.0lmol/L甘氨酸和0.5％BSA的PBS溶液（简称PBS-BSA）中5～10min。
•将5～10μl具有第一抗体的PBS-BSA溶液滴放在Parafilm上，用抗表面张力镊子把每个载网从PBS-BSA溶液移到抗体溶液上，孵育10～30min。
•用镊子将每个载网夹到少量的PBS液滴上清洗至少1min。放置3个较大的液滴，用金属丝环将载网移至较大的液滴上，每隔3min或更长时间将载网移入其中。假如研究的对象是膜结构，则用PBS-BSA来代替PBS。
•反复以上3环节，用第二抗体或附着3～20nm金颗粒的蛋白质A进行第二步免疫标记。
•用1％的GA将载网上的切片固定10min，以加强结构的完整性和抗体或蛋白质A与切片的交联。 •将网在水中清洗4次，每次2min，用于染色包埋。

平行双标记

从本质上说，它是平行地进行两个单标记，同时标记两个抗原。将由两种不同动物对两个抗原产生的两个抗体混合（如兔抗X抗体和豚鼠抗Y抗体）。按前面所述对该混合液进行第一步标记。交叉吸取两种动物IgG的抗体。将这些有标记的抗体混合，然后平行地对这两个第一抗体进行第二步标记。

GA阻断的系列多重标记

尽管上面描述的系列双标记在很多情况下进行得很好，但由于在一些情况下，蛋白质A与IgG的Fc和 Fab区都发生反映，以及胶体金标记的蛋白质A与抗体的解离，会显示错误标记。Slot等（1991）运用抗体即IgG对GA敏感而某些抗原不敏感这一优点克服了这个困难。在完毕第一个单标记后，用GA固定切片；这样AB1和PA都不再与下一阶段的AB2或PA发生反映。反复此流程，即 AB→PA：g→GA固定→淬灭残余的GA，这样就能成功地进行非常好的三重标记。

在这个流程中，对GA敏感的和不敏感的抗原进行标记时，对GA敏感的抗原一方面标记。应当仔细分析信噪比。现在系列双标记和系列多重标记是唯一对来源于同一种动物的抗体进行双标记的可行的方法。假如抗原对GA敏感但对FA不敏感，可以用FA代替GA。

电镜原位杂交

电镜原位核酸杂交技术的原理和操作环节与光镜原位杂交技术基本一致。杂交反映可在组织包埋前或包埋后进行，也可用在冷冻超薄切片上进行。

电镜原位杂交的准备

100×Denhardt溶液的配制：聚乙烯吡咯酮（PVP）10g，牛血清清蛋白（BSA）10g，聚蔗糖400（Ficol 400）10g，加H2O至500ml，过滤除菌，-20℃保存。

DEPC（二乙基焦碳酸酯）溶液的配制：取DEPC 1m1加入1,000m1双蒸水中，经振摇后，室温静置数小时，然后高压灭菌。

放标本的实验容器可用DEPC解决或高温180℃干烤2h。DEPC可灭活各种蛋白质，是RNA酶的克制剂。

包埋前原位杂交
将已完毕杂交操作的标本，按照常规电镜制样方法进行包埋、超薄切片、染色、电镜观测。其操作流程为：样品→固定（多聚甲醛-戊二醛混合液）→振动切片→原位杂交→示踪标记（胶体金或酶标）→锇酸固定→脱水→包埋→超薄切片→铀铅染色→电镜观测。

包埋后原位杂交
按照包埋后免疫标记电镜技术的制样方法，取材、固定、包埋、超薄切片，然后再进行原位杂交，其操作流程为：样品→多聚甲醛（或多聚甲醛-戊二醛）固定→低温脱水→低温包埋→超薄切片→镍网捞片→原位杂交→示踪标记（胶体金或酶标）→铀铅染色→电镜观测。

不包埋原位杂交
就是将细胞悬液、染色体和冷冻切片等样品，不进行包埋、涂片或切片即直接进行原位杂交。其操作流程为：活细胞悬液、染色体、冷冻切片→固定→原位杂交→胶体金标记→电镜观测

抗体的制备，标本的解决，免疫标记，对照实验、结果的观测和解析。

抗体的制备

特异性高、亲和力强的高效价抗体是获得抱负的免疫标记结果的首要条件要。抗体可购买或自己制备。大分子完全抗原，可直接免疫动物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠来获得抗体。半抗原，用偶联剂使半抗原与大分子物质结合成复合物，再去免疫动物产生抗体，大分子物质称为载体蛋白，以甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为常用。偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等。目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为抱负。

标本的解决

为了既能将抗原准拟定位甚至定量，又能观测到近似于生活状态下的细胞超微结构，必须选择合适的固定剂，慎重解决样品。

取材

单细胞：培养细胞或血细胞应随用随取。悬浮培养细胞可先离心（800 rpm，5 min），用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗1次后进行固定。贴壁细胞则可先将其培养在玻片上，用PBS轻轻冲洗后立即固定，也可用胰酶将细胞消化下来，按悬浮培养细胞的制备方法制备。

组织：取组织块时做到越快越好，最佳在没有停止血流前就取材。若观测的对象为肺、大脑、脊髓或内分泌器官等比较柔软的组织，应先做灌注固定，再用锐利的刀片将其切成约2 mm×2 mm×l mm大小的组织块，切时要避免挤压与牵拉，然后投入到固定液中继续固定。

固定
固定剂常会对抗原的活性产生不同限度影响，为了保存细胞的超微结构和抗原的活性，应通过预实验，拟定固定剂的种类、浓度、温度、pH及固定期间和方式，可用已知效价的抗原进行实验，选择合适的固定方法。

常用的免疫电镜标本固定液

多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PG）：1％多聚甲醛对组织细胞的抗原性影响不大，若加入超过0.1％戊二醛，抗原性就会迅速减弱；当戊二醛的浓度低到0.01％～0.05％时，对抗原性的影响便不显著，而细胞超微结构的保存也可获得很大改善。所以推荐用1％多聚甲醛加0.01％～0.05％戊二醛作为免疫电镜标本的固定剂，固定期间为4～5 h。对有些抗原性较强的标本，也可采用4％多聚甲醛加0.05％～0.5％戊二醛进行固定。某些抗原对戊二醛极其敏感，固定液只能用2～4%多聚甲醛，而不能加戊二醛。不充足的固定会导致抗原提取或移位，同时醛类等交联固定剂会改变蛋白质分子的结构而影响其抗原性，所以在不明显影响抗原性的前提下，选择合适的固定浓度和时间，尽也许强一些为好。

过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液（简称PLP）：PLP液含0.01 mol/L过碘酸钠、0.075mol/L赖氨酸、2％多聚甲醛及0.037mol/L磷酸缓冲液。其机制是借助过碘酸盐氧化抗原，一般为糖蛋白的糖类部分，使其羟基变为醛基，这样赖氨酸的双价氨基就能与醛基结合从而把抗原交联起来。由于大多数组织抗原含蛋白质与糖类，抗原决定簇位于蛋白部分，该固定剂有选择性地固定糖类，这样既稳定了抗原，又不影响抗原决定簇与抗体的结合。加入低浓度的多聚甲醛则能稳定蛋白与脂类。由于赖氨酸价格较贵，此固定液不如PG 固定液经济。

苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液（简称PAPG）：PAPG液含4％多聚甲醛、15％（V/V）苦味酸、0.5％戊二醛、pH为7.3。苦味酸穿透迅速，可在不影响抗原活性的前提下固定蛋白质，改善对膜和胞质的保存。特别是不能采用高浓度的戊二醛与锇酸做后固定期（如包埋后的免疫标记），在前固定液中加入苦味酸对超微结构的保存有很大帮助。

固定方法与时间

灌注固定：这是固定效果最佳的方式，能使超微结构得到很好的保存。以大鼠为例，麻醉后，用注射针头经左心室向积极脉灌注固定液，静脉压为120mm Hg柱，在5～15 min内每200g体重灌注150 ml固定液。

浸没固定：将手术或灌注后切成的标本块浸没在固定液中固定，浸没固定期间常为2～5h，游离细胞固定0.5～1h。

包埋

包埋剂类型：环氧树脂包埋剂和低温包埋剂。

包埋前免疫标记：即对已固定的样品先进行免疫标记，然后进行包埋、超薄切片并观测结果，一般选用环氧树脂包埋剂。环氧树脂本质是疏水性的，在包埋前样品必须先进行完全脱水，然后在温箱中进行热聚合。热聚合会使大多数抗原变性，因此该包埋剂不合用于包埋后免疫标记。

包埋后免疫标记：指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再进行免疫化学标记的方法，此方法多用低温包埋剂，如Lowicryl系列包埋剂、 LR White包埋剂和LRGold包埋剂。这三种包埋剂均能在低温下（-35℃～-80℃）用紫外光（波长315～360nm）进行聚合，避免了高温对抗原性的负面影响，提高了阳性标记率，并且对胶体金的非特异性吸附少，对温度敏感的抗原应选择使用低温包埋剂。

免疫标记

根据免疫标记与标本包埋之间的不同关系，可分为包埋前免疫标记、包埋后免疫标记和不用包埋的冷冻超薄切片免疫标记。根据具体的标本、抗原的部位及性质并结合实验室的具体条件选择恰当的方法。这三种免疫标记方法，都涉及非特异性位点的封闭、抗体与抗原特异性结合的免疫反映、反映部位的示踪显示等基本环节。

包埋前免疫标记

优点一是切片在免疫标记前不经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程，抗原活性不会受到上述过程的影响，并且抗原暴露充足，标记的阳性率高，非特异性反映少。二是免疫标记后还可进行半薄切片，在免疫反映阳性部位做定位超薄切片，进一步提高电镜的检出率。三是免疫标记完毕后，用戊二醛与锇酸再次固定组织，可使抗原抗体的结合更加牢固，并有助于膜结构的保存。

包埋前免疫标记重要用于细胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脱水剂和树脂成分溶解和变性的抗原的检测。包埋前免疫标记细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制，为了提高对细胞内抗原的标记率可以采用以下措施：

厚切片

厚切片进行包埋前免疫标记，需将固定后的组织厚切片（单细胞团不需厚切片），以利于标记抗体的穿透。厚切片的方法有以下几种：

冰冻切片：用恒冷箱冰冻切片机将固定后的组织块切成8μm左右的厚片。将切下的厚片放入盛有PBS的小玻璃瓶内备用。也有的将厚片直接贴在载玻片上进行免疫标记，这样做虽然操作比较方便，但因抗体只能与厚片的一面接触，所以会在一定限度上影响标记的阳性率。

震动切片：震动切片可以切出20μm～30μm的厚片，免疫电镜用只需20μm～80μm的切片。震动切片的优点是可以避免冰冻对组织带来的损害，但它切出来的切片过厚，即使在使用穿透剂的条件下，免疫试剂也仅能穿透切片表面8μm～9μm，而更深层的组织就不易被标记。

增长细胞膜的通透性

用0.01％Saponin或0.1％Triton X-100等活性剂解决5～8min，以增长细胞膜的通透性。但这些化学物质会对超微结构产生一定限度的破坏，所以应根据不同的组织或细胞，严格控制活性剂的应用浓度与时间。也可用冻融的方法增长细胞膜通透性，标本先进行防冰晶解决（厚片在含15％甘油、20％蔗糖的PBS中振摇沉底），在液氮中速冻 0.5～1min后用PBS迅速回温。

选用相对分子质量较小的标记物

辣根过氧化物酶与IgG的Fab片段交联物，分子质量较小，约100kD，较易进入细胞内。也可用IgG Fab-lnm金作为标记物，标记后经银加强染色的纳金包埋前标记法。由于该标记物较易穿透到组织和细胞内，且定位比酶标抗体精确，因此被广泛用于膜受体的精拟定位。

包埋后免疫标记
包埋后免疫标记具有超微结构保存较好、方法简便可靠、阳性结果反复性高的优点，可对同一组织块的连续切片做各种对照免疫