ELISA实验操作中常见问题分析.doc

由于 ELISA(酶联免疫试验)具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。优质的 试剂 ，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象（就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高）是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。 1标本及采集、贮运因素 严重溶血 ，以 HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性； 混有红细胞的血清 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有 细菌污染 ，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应； 标本凝固不全 ，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果； 采血试管洗涤不彻底 、反复使用易交叉污染； 塑料试管能吸附抗原物质 ，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。 血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于4，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的 试剂 本底加深。超过一周测定的需20保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使 抗体 效价跌落，所以测 抗体 的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存；最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性；血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。 2、试剂的影响 ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应 试剂 盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类 试剂 盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持 试剂 盒高的流行病学敏感度，科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性，就HCV-ELISA 试剂 盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段；第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段；第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代 试剂 的敏感度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下： 基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或 酵母 菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点： a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。 b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使 试剂 盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的 试剂 盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。 c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高 试剂 盒的灵敏度，提高检出率。 d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。 合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点： a.分子量太小；b.一般只含有一个抗原决定簇；c.纯度高；d.稳定性差。 国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为 89.4%99.3%,78%89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。 选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的主要依据。 要注意试剂的批号和出厂日期，虽然试剂的有效期多为 1年。最好选择刚出厂的试剂使用。 不同厂家的试剂不能混用。 不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用 ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。 3、操作技术的影响 操作过程的控制： 严格按照试剂说明书进行操作。操作前将试剂在室温下平衡3060min。 加样后及时放人孵箱。标本较多时，要分批操作。按说明步骤严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。 (3)封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板”的出现。 (4)用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干：还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。 (5)合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时间长。 (6)加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。 (7)显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。 (8)加样时保持显色剂不外流；A、B液应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。 (9)应保证酶标板清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至最低限度。从而提高检测的特异性。并得到更准确、可靠的实验结果。 加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。加样时应将所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。 温浴影响，在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原 抗体 反应一般在37经1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的 试剂 盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。96孔酶标板结构特别；易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。 洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，各种 试剂 盒的洗液不要混用。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。洗液需要稀释，应按要求稀释。配制洗液应用新鲜的和高质量的纯化水，电导率小于1.5s/cm，洗液如果结晶应待其融解后配制。手洗条件一致性较差，对结果影响较大，防止洗液在孔内形成气泡。半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。 保证洗板浸泡时间为 40 秒左右，孔内液体被洗板机吸得越干净洗涤效果更好，手工洗板 4.显色和比色 TMB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间（12-24 小时）不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（450nm）测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA 结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为1%，重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15 -30 ，使用前先预热仪器 15-30 分钟，测读结果更稳定。 测读 A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1），第二次在不敏感波长（W2），两次测定间不 移动ELISA 板的位置，最终测得的A 值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。 肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。 5.HooK效应影响 随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。影响检测结果，采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减HooK反应的发生。 6.干扰物质的影响 有人认为大约 40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用5630分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。 7.药物的影响 高效价的乙肝免疫球蛋白会与 HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出，所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现，如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射200mg乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的检出；而且其所生产的生新儿也常出现HBsAg阴性，HBeAg 阳性和HBcAb阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物；则新生儿HBsAg检测呈阴性；用0.5M的盐酸处理标本1小时可提高出率。 为预防乙肝，部分 HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的12周内，血清中可检出HBsAg成份，形成一过性HBsAg阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能够把它检出；如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。 8.抗原自身因素 融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断 试剂 盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。 少数 HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg， 含量在5ng600g/ml之间。据文献报道，到目前为止在献血员中所发现的HBsAg 携带者最低含量为0.2 ng/ml。含量高者可达2000g/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如暴发性乙型肝炎、HBV的S基因发生变异等。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg，从而使外周血中无HBsAg。HBV的前S/S基因编码HBsAg，构成病毒外膜，根据所带亚型决定簇的不同分为adw、adr、ayw和ayr。a决定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs应答。如S基因145密码子变异使得其原来的甘氨酸被精氨酸替代时，可致a决定簇的抗原性发生改变，使机体产生的抗体对变异株无作用，且可引起HBV感染患者血清中同时出现HBsAg和抗HBs。同时乙肝疫苗接种也不能有效预防此类变异病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的变异有自然变异和逃避免疫变异，变异可发生在多个部位，而且几处突变可同时存在，这些变异有助于病毒携带状态的持续存在。近来，有研究表明，前S1区丢失突变（氨基酸58118）是引起HBsAg阴性的HBV感染的重要原因，S启动子位于前S1，是合成HBsAg的调节元件，前S1的丢失突变则会影响S启动子的功能，进而影响HBsAg的合成。 总之，优质的 试剂，良好状态的仪器，排除各种影响因素的干扰和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。 异常 结果描述 原因分析 对策 白板 显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。 试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用 检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。 错加、漏加试剂底物、显色剂 A或B 严格按说明书的步骤操作，加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象。 洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力 确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净。 终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制 每次配制时都应看清标签标明物质。 蒸馏水有问题 确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好蒸馏水比较。 显色弱、灵敏度低 实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。 试剂盒超过期， 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号； 试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响； 实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。 不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储藏。 试剂、样品用前未平衡至室温 从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡 20分钟左右。 加入试剂的体积和时间有误， 移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁； 确定所使用的试剂体积正确，加入时间适当。 校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应完全。 洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力； 确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。 孵育时间及孵育温度未达到要求 ，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。 孵育温度应控制在 37-38，孵育时间严格按照说明书操作。 保温期内不宜多开门，以免影响保温。 洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求；洗涤冲击力太大。浸泡时间太长； 严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。 显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入； 显色剂滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不宜过快，先加显色剂 A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入。 底物作用时间不够； 准确定时。 蒸馏水水质有问题； 测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。 实验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本感觉显色较弱 待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的 如有怀疑，可复检 标本加入叠氮钠作为防腐剂 酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用 proclin、硫柳汞等其他防腐剂 阴阳性对照正常，但质控、参考品或个别弱阳性标本未能检出。 未达要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但 质控或弱阳性标本受 温度变化影响较大而被未检出。 确认孵育的温度及孵育时间达到要求。 质控品或标本高温放置过久，或被反复冻融致待测物滴度下降，而未能检出 质控品或标本避免反复冻融。标本在一周内使用的，可存于 2-8，如需长期保存，应置于-20以下保存。质控品应小量分装，并置于-20以下保存。 仪器设定不正确，滤光片不匹配。 重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。 终止后，目测结果正常，但酶标仪读值结果偏低 酶标仪参数设定不正确。 重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。 灵敏度过高、板底高、高背景 终止后，整板结果显现均一的黄色或淡黄色；或阴阳性对照、质控正常，标本阴性标本 OD值过高。 整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成，如同时操作两对半试剂时，测 HbsAb板用于测HBsAg等； 实验前检查试剂的组分及批号，确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。 酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象； 避免试剂组分间的交叉污染，确保吸头、容器的干净。 显色剂在光照条件下放置过久，实验前已变蓝 显色剂 A、B未使用前避光保存 孵育温度过高或孵育时间过长； 孵育温度应控制在 37-38，孵育时间严格按照说明书操作。 未按要求洗板。特别是洗涤时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象 严格按说明书要求洗板。 花板，一般是由于临床标本的收集、处理和保存方法不当造成 放置时间（自然放置 12h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。 出现随机性的花板、跳孔现象 样品离心不完全，反应孔内发生凝血或残留细胞成分； 充分离心， 3000rpm6分钟以上。 加样时交叉污染； 加标本时尽量 避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。 手工洗板造成的交叉污染 手工洗板时前 3次注洗液后应立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染 洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大，造成 花板、跳孔 疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要小。 拍板时交叉污染 洗板完毕拍板时用合适的吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。 假阳性 假阳性现象是一个综合现象，可参考上文 “灵敏度过高、板底高、高背景” 中的分析。这里只列举常见的原因及对策。 计算 Cutoff值时使用的公式不正确，导致计算得出的CutOff值过低，从而导致出现假阳性 CutOff值计算公式应严格参照所属产品的说明书，应注意各个酶免产品的Cutoff值计算公式不尽相同。 洗板时未能注满洗液或洗板次数、浸泡时间不够， 洗涤不充分，样品中有其他成分残留 导致花板、跳孔，假阳性增多 严格按说明书要求洗板。调整洗板机时，应注意有时仪器标示的液量与实际液量并不相符，应根据实际情况调整至每孔注满。 血清标本处理不当，如未除去细胞成分、纤维蛋白原及其它干扰物可出现孔底由变蓝的跳孔现象，此标本重复实验结果往往是阴性； 放置时间（自然放置 12h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。 厂家试剂质量的变化造成； 国家标准要求提高灵敏度时，厂家试剂灵敏度也相应提高，假阳率常常有所上升，但只要在合理范围，是可以接受的。 水质问题； 防止蒸馏水污染。 加酶量过多（如 50uL误认为100uL）或丙肝酶稀释时加量过多； 加酶前检查移液器调节量是否准确，稀释酶时思想要集中。 培养箱温度超过 37或酶结合物反应时间或底物显色时间超过； 放入板以前要检查培养箱的温度，准确定时。 底物配制时间过长、或底物污染； 底物应在酶反应完毕即将洗涤前 5分钟配制，注意避光。 该批样品放置时间过长，样品污染； 样品应保持新鲜，或低温保存，防止污染。 移液嘴重复使用，未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物； 移液嘴尽可能一次性使用。 重复性差 1、样品数量不一，加样时间长短不一； 重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近。 2、样品加入后未混匀； 加样后在混匀器上充分混匀。 3、酶标仪滤光片不对或输入波长不对； TMB显色用450/630波长. 4、酶标仪测定重复性差； 校对酶标仪。 5、洗涤不正确； 洗涤液注满各孔但不要溢出。洗板时反应板面向下，垂直用力甩净内容物（可多甩几次），在干净、无或少尘的吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔，洗涤应充分。 6、温育条件不一致（一次用水育，一次用恒温箱） 恒温箱温育较水浴显色深， OD值高出0.1-0.15,最好均采用恒温箱.如用水浴水温应控制在37。 7、不慎多加或少加酶或显色剂； 多加时显色深，少加则浅，用记号笔圈上，便于分析。 8、阈值附近时阴时阳； 同一样品做三个复孔，以二个（含二个以上相同结果为准） 9、加样量不足、保温时间、洗涤条件一致； 尽可能使用同一移液器和装紧吸嘴重复测定标本。条件、人员等应尽量与上次保持一致。