westernblot条带分析及解决方法剖析.doc
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1、现象原因解决反影(白色条带,黑色背景)1 HRP过高(背景较高)至少成倍稀释一抗/二抗(可410倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色2 HRP过高(敏感性太高)至少成倍稀释一抗/二抗(可410倍)*注2信号弱或无3 HRP过高引起底物迅速耗竭至少成倍稀释一抗/二抗(可410倍)*注34 抗体-抗原系统敏感性过低提高抗体浓度/蛋白上样量*注45 转膜不充分/过转优化转膜条件*注56 HRP或底物活性降低测试活性或选用敏感底物 *注6高背景7 HRP过高(背景较高)至少成倍稀释一抗/二抗(可410倍)*注78 封闭时间不足延长封闭时间4度过夜最好*注89 抗体与封闭液有交叉更换封闭液(如3%BSA的
2、TBST)*注910 TBST洗脱不足增加洗脱时间、次数、用量*注1011 暴光时间过长降低暴光时间*注1112 抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点13 转膜不良(如有气泡在胶-膜之间)精细操作*注1314 膜平衡不均/油脂污染按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注1415 膜与X光片间有气泡显影前去除气泡*注15非特异性条带16 抗体交叉反应至少成倍稀释一抗/二抗(可410倍)*注1617 SDS非特异性结合蛋白条带使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑18 封闭液有杂质颗粒静置牛奶使大颗粒沉淀,仅用上层*注18*注1 其具体问题有二:一是背景较高,二是没有
3、条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭,则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决,要么动作迅速早期未耗竭底物时压片,否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊,但条带中心是空的白色,原因和上面的一样,主要是条带中心耗竭底物引起的,也可以在暗室看到中空的荧光带,但与上面的区别主要在于特异性要好一些,若继续发展则就是原因
4、3的现象。其分析和解决同上。*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的产物使膜发黄,压出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的现象同时存在,只是一种现象,在压过的膜可以看出来(只在加底物后一段时间出现,几小时后可能还会消退,有时甚至刚加底物12min就可以看出来,所以要把握时机)。如果没有达到原因1和原因3的程度,那么这种情况一定能够看到很强的荧光,是一种良好的状态,是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因1和原因3的现象,可以不予处理。但因为荧光太强极易导致条带增粗变大,所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决,一般压10s30s,甚至可以35s,即时根据结果在暗室调整,荧光持
5、续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。但也有这种情况,就是由于HRP过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大(如果时间过短如100kd)蛋白而言,一般不会出现过转情况,转膜不充分是主要原因,增加转膜力度无非是加大电压/电流,延长时间。但对于小分子蛋白(30kd就要注意了,15kd尤其要当心)很可能出现过转,丽春红染膜或观察marker有没有穿膜可以确认,没有丽春红也可以考染转膜后的胶,如果是一片空白,则要小心了,可适当降低转膜力度。对于低分子量一般转膜液不要加SDS以防过转,抗体技术实验指南提供的针对中低分子量的湿转缓与高分子量的相比也是不含SDS的。*注6 测试HRP或底物活性:于暗室E
6、P管加底物A、B液各500ul,加入1ul HRP偶联二抗,若底物立即发出蓝光并于随后数分钟内消失说明HRP和底物尚好。此外试剂公司还开发一些超级底物,其敏感度可达到pg级,但价格昂贵,对某些表达较低的蛋白效果会好些,而且也超级省抗体(其推荐抗体稀释比高达1:10,000以上)。我用的是敏感度为ng级的底物,大部分western都还可以,pg级的还放在手里,没舍得用。*注7 高背景原因是因为HRP偶联二抗结合到膜上,其原因包过直接结合、通过膜上蛋白间接结合、通过一抗(主要指多抗中的杂抗体)间接结合、通过封闭物(与封闭物交叉反应)间接结合、洗脱不彻底等原因造成的。在稀释抗体降低背景的同时也会降低
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