植物组织培养技术PPT课件.ppt
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1、1 1 实验室设置及仪器设备实验室设置及仪器设备2 2 实验基本操作实验基本操作3 3 培养基的成分及其配制培养基的成分及其配制4 4 培养条件的选择培养条件的选择植物细胞工程实验室及基本操作植物细胞工程实验室及基本操作11 1 实验室设置及仪器设备实验室设置及仪器设备 实验室是进行组培研究的主要场所,应实验室是进行组培研究的主要场所,应能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌能满足清洗、培养基制备、储藏、无菌操作、培养、鉴定等多方面的工作。操作、培养、鉴定等多方面的工作。2 1 1基本实验室基本实验室1.1 1.1 洗涤间洗涤间 根据工作量的大小决定其大小,一般面积控根据工作量的大小决定其大小,一
2、般面积控制在制在30-50m30-50m2 2。在实验室的一侧设置专用的洗涤水。在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽,用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置槽,用来清洗玻璃器皿。中央实验台还应配置2 2个水槽,用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大,个水槽,用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大,可以购置一台洗瓶机。准备可以购置一台洗瓶机。准备1-21-2个洗液缸,专门个洗液缸,专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿。此外还应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。应配置落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等。地面应耐湿并排水良好。地面应耐湿并排水良好。34面积面积
3、60平方米左右,配备的主要仪器设备有平方米左右,配备的主要仪器设备有:冰:冰箱、天平、微波炉、箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、药品计、培养基分装器、药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。冰箱以体积等。冰箱以体积180-200L为宜,用于储存培养基为宜,用于储存培养基母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保母液、激素维生素等贵重药品、彩色胶卷、及保存植物材料。天平应有不同感量。存植物材料。天平应有不同感量。1.2培养基配制间培养基配制间56配备实
4、验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细配备实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实应根据不同的要求选择不同型号的灭菌锅。一般实验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅,较大的验室可选用小型的医用手提式高压灭菌锅,较大的实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。实验室可选用立式自动控制压力和温度的灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。生产性的实验室可选用大型的卧式灭菌锅。如果没有条件的话,可以将上述工作间合并如果没有条件的话,可以将上述工作间合并成一个准备间,要求是设
5、备的安装和排列要合理、成一个准备间,要求是设备的安装和排列要合理、房间要宽敞、明亮、透风,地面要便于清洁、防滑。房间要宽敞、明亮、透风,地面要便于清洁、防滑。1.3消毒间消毒间78无菌操作室主要用于实验材料的接种操作,所以又叫无菌操作室主要用于实验材料的接种操作,所以又叫接种室。通常由里外两间组成,外间是缓冲间,用于接种室。通常由里外两间组成,外间是缓冲间,用于准备工作,还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与准备工作,还有防止污染的作用。缓冲间的门应该与接种室的门错开,两个门也不要同时开启,以保证无接种室的门错开,两个门也不要同时开启,以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设菌室不
6、因开门和人的进出带进杂菌。缓冲间内应该设有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操有水槽、实验台、鞋帽架、和柜子、紫外灯。无菌操作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修,工作人员进入作室的内壁应当用塑钢板或瓷砖装修,工作人员进入操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。操作间前要穿上消过毒的工作服和拖鞋。室内应配有超净工作台,紫外灯、解剖镜、各种室内应配有超净工作台,紫外灯、解剖镜、各种接种器械等。接种器械等。1.4无菌操作室无菌操作室910为了控制培养室的温度和光照时间及其强度,培养为了控制培养室的温度和光照时间及其强度,培养室的房间不要窗户,但应当留一个通气窗,并安上排气室的房间不要窗户,但应当留一
7、个通气窗,并安上排气扇。室内温度由空调控制,光照由日光灯控制。天花板扇。室内温度由空调控制,光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修,地面用水磨石或瓷砖铺设,和内墙最好用塑料钢板装修,地面用水磨石或瓷砖铺设,一般要分两间,一为光照培养室,一为暗培养室。培养一般要分两间,一为光照培养室,一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用生化培养箱、自动控时器等。日光灯一般用40W,固定,固定在培养架的侧面或搁板的下面,每层有两支日光灯,距在培养架的
8、侧面或搁板的下面,每层有两支日光灯,距离在离在20cm,光照强度为,光照强度为2000-3000lx。1.5培养室培养室1112132 2辅助实验室辅助实验室 2.12.1鉴定室鉴定室 细胞学鉴定室细胞学鉴定室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥,使各种光学仪定和研究。要求清洁、明亮、干燥,使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。系统等。生化分析室生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验在以培养细胞产物为主要目的的实验室中,应建立相应的分析化验实验室,以便于对培室中,
9、应建立相应的分析化验实验室,以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。养物的有效成分随时进行取样检查。离心机、酶联离心机、酶联免疫检测仪、天平、免疫检测仪、天平、PCRPCR仪等。仪等。1415为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。为试管苗提供满足生长的适宜环境条件。2.2、温室、温室16(1)(1)洗涤液的洗涤液的配制配制2 2 实验基本操作实验基本操作一一.洗涤技术洗涤技术17A A、新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质,可先用质,可先用0.5的去污剂洗刷,再用自来水洗净,的去污剂洗刷,再用自来水洗净,然后浸泡在然后浸泡在12盐酸溶液中过夜(不可
10、少于盐酸溶液中过夜(不可少于四小时),再用自来水冲洗,最后用无离子水冲四小时),再用自来水冲洗,最后用无离子水冲洗两次,在洗两次,在100120烘箱内烘干备用。烘箱内烘干备用。(2)(2)洗涤方法洗涤方法18 先用自来水洗刷至无污物,再用合适的先用自来水洗刷至无污物,再用合适的毛刷沾去污剂(粉)洗刷,或浸泡在毛刷沾去污剂(粉)洗刷,或浸泡在0.50.5的清洗剂中超声清洗(比色皿决不可超声),的清洗剂中超声清洗(比色皿决不可超声),然后用自来水彻底洗净去污剂,用无离子水然后用自来水彻底洗净去污剂,用无离子水洗两次,烘干备用(计量仪器不可烘干)。洗两次,烘干备用(计量仪器不可烘干)。清洗后器皿内外
11、不可挂有水珠,否则重洗,清洗后器皿内外不可挂有水珠,否则重洗,若重洗后仍挂有水珠,则需用洗液浸泡数小若重洗后仍挂有水珠,则需用洗液浸泡数小时后(或用去污粉擦洗),重新清洗。时后(或用去污粉擦洗),重新清洗。B B、使用过的玻璃仪器的清洗、使用过的玻璃仪器的清洗19聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿,在生物化学聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿,在生物化学实验中已用的越来越多。第一次使用塑料器皿时,实验中已用的越来越多。第一次使用塑料器皿时,可先用可先用8mol/L尿素(用浓盐酸调尿素(用浓盐酸调pH=1)清洗,接)清洗,接着依次用无离子水、着依次用无离子水、1mol/LKOH和无离子水清洗,和无离子水
12、清洗,然后用然后用103mol/LEDTA除去金属离子的污染,最除去金属离子的污染,最后用无离子水彻底清洗,以后每次使用时,可只用后用无离子水彻底清洗,以后每次使用时,可只用0.5的去污剂清洗,然后用自来水和无离子水洗净的去污剂清洗,然后用自来水和无离子水洗净即可。即可。C、塑料器皿的清洗塑料器皿的清洗20金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤(新的金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤(新的可以用热洗衣粉水洗净),需要清洗时,一可以用热洗衣粉水洗净),需要清洗时,一般用酒精擦洗,然后火焰干燥。般用酒精擦洗,然后火焰干燥。E E、除菌过滤器用清水冲洗后,用洗液冲洗,、除菌过滤器用清水冲洗后,用洗液冲洗,再
13、用清水冲洗,最后用蒸馏水冲洗,晾干备再用清水冲洗,最后用蒸馏水冲洗,晾干备用。用。D D、金属用品洗涤、金属用品洗涤21(一)、灭菌工作是极其重要的。(一)、灭菌工作是极其重要的。首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴:首先应建立有菌和无菌的概念有菌的范畴:有菌:有菌:凡是暴露在空气中的物体,至少其表面都是有菌的。凡是暴露在空气中的物体,至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超净工作台的台面,未处理的工具和手等。如植物的表面、超净工作台的台面,未处理的工具和手等。无菌无菌:高压高温处理(工具、器皿、培养基等):高压高温处理(工具、器皿、培养基等)物理或化学处理;物理或化学处理;火烤后的物体;火烤后
14、的物体;健康的动植物不与内外部表面接触的组织健康的动植物不与内外部表面接触的组织 内部可能是无菌的(有时也有内生菌,但内部可能是无菌的(有时也有内生菌,但 不会影响培养,也不会污染)不会影响培养,也不会污染)二二.灭菌灭菌221 1、物理方法物理方法:干热、湿热、过滤(:干热、湿热、过滤(0.250.25微微米)紫外灯、超声波等。米)紫外灯、超声波等。2 2、化学方法化学方法:使用灭菌剂或抗菌素,如酒:使用灭菌剂或抗菌素,如酒精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、精、次氯酸钠、升汞、漂白粉、高锰酸钾、双氧水、福尔马林等双氧水、福尔马林等 (二)、灭菌的方法(二)、灭菌的方法23干热灭菌干热灭菌
15、 玻璃器皿、器械玻璃器皿、器械 湿热灭菌湿热灭菌 培养基、蒸馏水、器械、棉塞等培养基、蒸馏水、器械、棉塞等熏蒸灭菌熏蒸灭菌 接种室、培养室接种室、培养室过滤灭菌过滤灭菌 液体培养基、蒸馏水液体培养基、蒸馏水药剂灭菌药剂灭菌 培养材料培养材料烧灼灭菌烧灼灭菌 器械、瓶口、棉塞、包头纸器械、瓶口、棉塞、包头纸辐射灭菌辐射灭菌 接种室。培养间接种室。培养间各种灭菌方法及其使用范围各种灭菌方法及其使用范围24适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。操作方法:法:150 150、40min40min或或120 120、120min120min,如,如果发现芽孢杆菌,果发现芽
16、孢杆菌,160 160、9090120min120min(1 1)干热灭菌)干热灭菌25适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。棉塞、纸等。121 121 维持维持202030min30min注意点:加足水、排尽气、气压降到注意点:加足水、排尽气、气压降到0 0时,时,才能开盖才能开盖(2 2)湿热灭菌)湿热灭菌26 培养基的灭菌一般用高压高温处理,但如果培培养基的灭菌一般用高压高温处理,但如果培养基中某些成分遇到高温分解(如某些生长调节剂养基中某些成分遇到高温分解(如某些生长调节剂GA3GA3、玉米素等),就需要过滤灭菌。另外酶、血、玉米素等)
17、,就需要过滤灭菌。另外酶、血清等也需要过滤灭菌清等也需要过滤灭菌 灭菌方法:将生长调节剂或酶配成一定浓度,灭菌方法:将生长调节剂或酶配成一定浓度,用注射器注入微孔滤膜虑,滤膜孔径用注射器注入微孔滤膜虑,滤膜孔径0.220.220.450.45微微米。制培养基时,现将培养基高压灭菌,待降至米。制培养基时,现将培养基高压灭菌,待降至5050左右时,加入适量的激素,然后分装。左右时,加入适量的激素,然后分装。(3 3)过滤灭菌)过滤灭菌27主要是利用紫外灯进行照射,适合实验室主要是利用紫外灯进行照射,适合实验室空气、操作台等,灭菌时间空气、操作台等,灭菌时间202030min30min。注意:关灯后
18、注意:关灯后5min5min后再进入。超净工作台后再进入。超净工作台关灯后要打开风机。关灯后要打开风机。(4 4)射线灭菌)射线灭菌28用火焰灼烧达到灭菌目的,适用于用火焰灼烧达到灭菌目的,适用于接种器皿的灭菌。接种器皿的灭菌。(5 5)火焰灼烧灭菌)火焰灼烧灭菌29适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。适用外植体、实验器皿、操作表面、皮肤等。几种常用消毒剂的效果比较几种常用消毒剂的效果比较消消 毒毒 剂剂使用浓度使用浓度(%)(%)消毒时间消毒时间(min.)(min.)效效 果果残液去除残液去除难易难易乙醇乙醇70-7570-750.1-30.1-3好好易易新洁尔灭新洁尔灭1010202
19、05 53030好好易易氯化汞氯化汞0.10.11 12 21515最好最好最难最难过氧化氢过氧化氢101012125 51515较好较好最易最易抗菌素抗菌素4 450mgl50mgl-1-130306060较好较好较难较难次氯酸钙次氯酸钙/纳纳9 9 10105 53030好好易易(6 6)消毒剂)消毒剂30长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法:长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。方法:甲甲醛、高锰酸钾熏蒸醛、高锰酸钾熏蒸。甲醛的用量通常按每立方米空间甲醛的用量通常按每立方米空间2-62-6毫升计算,毫升计算,高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准备妥当后,高锰酸钾的用量是甲醛的一半。室内准
20、备妥当后,把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内(最好在碗或最好在碗或杯下面铺一张报纸,以利清洗杯下面铺一张报纸,以利清洗),然后将甲醛也倒,然后将甲醛也倒入碗或杯内,立即出屋关门。几秒钟后,甲醛溶液入碗或杯内,立即出屋关门。几秒钟后,甲醛溶液即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂,当它与一部即沸腾挥发。高锰酸钾是一种氧化剂,当它与一部分甲醛作用时,由氧化反应产生的热可使其余的甲分甲醛作用时,由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。醛挥发为气体。熏蒸灭菌熏蒸灭菌31甲醛熏蒸接种室应至少在使用前甲醛熏蒸接种室应至少在使用前2424小时进行,熏蒸后小时进行,熏蒸后密闭保持密
21、闭保持4 4小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、小时以上再进入室内工作。甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。因此,可在使用前用氨进行中和。鼻有强烈刺激作用。因此,可在使用前用氨进行中和。取与甲醛等量的氨水,倒在另一个烧杯里,迅速放入取与甲醛等量的氨水,倒在另一个烧杯里,迅速放入熏蒸室内,使甲醛和氨水发生中和反应,以消除甲醛熏蒸室内,使甲醛和氨水发生中和反应,以消除甲醛味,减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前味,减少对人体的刺激作用。使用氨水应在工作前2 2小时进行。小时进行。对有材料的培养室,也可以采用乙二醇加热熏蒸对有材料的培养室,也可以采用乙二醇加热熏蒸32人为因素(工作人员本身):工作
22、服、帽、口罩、酒精擦手。人为因素(工作人员本身):工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素物品因素器器皿皿和和用用具具培养皿:洗培养皿:洗热压热压 玻璃器皿:洗玻璃器皿:洗干热(干热箱)或晾干干热(干热箱)或晾干 接种用具:用接种用具:用CCLCCL4 4布擦布擦湿布擦湿布擦 泡泡75%95%75%95%酒精酒精烧烧培养基:湿热培养基:湿热培培养养材材料料外部细菌:用水冲洗外部细菌:用水冲洗化学药剂处理化学药剂处理 内部细菌内部细菌 茎尖培养茎尖培养 加抗生素:青霉素、利福平加抗生素:青霉素、利福平操作的空气:洗刷地板操作的空气:洗刷地板95%酒精擦超净工作台酒精擦超净工作台 用化学试剂薰蒸用化学
23、试剂薰蒸污染来源污染来源三、无菌操作技术三、无菌操作技术331 1、实验器具和材料的准备、实验器具和材料的准备2 2、用、用75%75%的酒精擦拭超净工作台,然后室内及超的酒精擦拭超净工作台,然后室内及超净工作台用紫外灯杀菌净工作台用紫外灯杀菌20min-30min20min-30min。注意:台面。注意:台面上的用品不要放置太多或重叠放置,以免降低灭上的用品不要放置太多或重叠放置,以免降低灭菌效果。菌效果。3 3、关紫外灯、打开风机,过、关紫外灯、打开风机,过5-10min5-10min进入缓冲间,进入缓冲间,以以75%75%洗手和手臂,更换无菌服、帽子和口罩。进洗手和手臂,更换无菌服、帽子
24、和口罩。进入接种室。(注:没有特别情况,尽量不要下工入接种室。(注:没有特别情况,尽量不要下工作台)作台)344 4、用、用70707575的酒精拭擦台面并消毒双手。试验的酒精拭擦台面并消毒双手。试验用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯,将金属器械用具也应该用酒精消毒。点燃酒精灯,将金属器械在其火焰上灼烧,冷却待用。在其火焰上灼烧,冷却待用。注意:所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金注意:所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。金属器械不能过度灼烧,以防退火。移液管不能灼烧,属器械不能过度灼烧,以防退火。移液管不能灼烧,培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不
25、能时间太长。长。355 5、取流水冲洗(至少、取流水冲洗(至少30min30min)过的外植体,用一定)过的外植体,用一定的消毒剂浸泡消毒,用无菌水冲洗的消毒剂浸泡消毒,用无菌水冲洗3434次,放入无菌次,放入无菌培养皿中,置于酒精灯火焰下方,用无菌的接种器培养皿中,置于酒精灯火焰下方,用无菌的接种器械进行分离、切割或其他处理。械进行分离、切割或其他处理。366 6、打开培养瓶,瓶口在灯焰处旋转灼烧,用镊、打开培养瓶,瓶口在灯焰处旋转灼烧,用镊子将培养材料置于培养基上,灼烧镊子放回,子将培养材料置于培养基上,灼烧镊子放回,灼烧瓶口,盖上瓶塞。灼烧瓶口,盖上瓶塞。7 7、用酒精擦洗工作台和手。进
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