生物芯片技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx
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1、生物芯片技术生物芯片技术(BIOCHIP TECHNOLOGY)BIOCHIP TECHNOLOGY)第1页研究历史研究历史(Research history)1991 Affymatrix企业Stephen Fodor:光刻与光化学技术、多肽和寡聚核苷酸微阵列。DNA Chip概念 Stanford大学Brown试验室:预先合成,机械手阵列1995 Schena等:基因表示谱1996 Chee et al:DNA测序1996 Cronin et al:突变检测1996 Sapolsley&Lipshutz:基因图克隆1996 Shalon et al:复杂DNA样本分析1996 Shoema
2、ker et al:缺省突变定量表型分析第2页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术生物芯片(biochip)概念指采取光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物表面,组成密集二维分子排列,然后与已标识待测生物样品中靶分子杂交,经过特定仪器对杂交信号强度进行快速、并行、高效地检测分析,从而判断样品中靶分子数量。第3页依据生物分子之间特异性相互作用原理,如DNA-DNA、DNA-RNA、抗原-抗体、受体-配体之间可发生复性与特异性结合,设计一方为探针,并固定在微小载体表面,经过分子之间特征性反应,检测另外一方有没有、多少或者结
3、构改变等第4页生物芯片(Biochip或Bioarray)是指包被在固相载体上高密度DNA、抗原、抗体、细胞或组织微点阵(microarray)。未来十年最具发展潜力技术。第5页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术生物芯片主要特点:高通量、微型化和自动化高通量、微型化和自动化惯用生物芯片分类:基因芯片、蛋白质芯片及芯片试验室第6页特点特点高度并行性:提升试验进程、利于显示图谱快速对照和阅读。多样性:可进行样品多方面分析,提升准确性,降低误差。微型化:降低试剂用量和反应液体积,提升样品浓度和反应速率。自动化:降低成本,确保质量。第7页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术1.基因芯片(Gene
4、chip)又称DNA芯片,是依据核酸杂交原理,将大量探针分子固定于支持物上,然后与标识样品进行杂交,经过检测杂交信号强度及分布来进行分析。第8页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术2.蛋白质芯片(proteinchip)利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应原理,将蛋白质分子(抗原或抗体)结合到固相支持物上,形成蛋白质微阵列,即蛋白质芯片。第9页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术3.芯片试验室(labs-on-chip)高度集成化集样品制备、基因扩增、核酸标识及检测为一体便携式生物分析系统。实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成,从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。芯片试验室是生物芯片
5、技术发展最终目标。第10页其它分类方法(依据应用)其它分类方法(依据应用)基因变异检测芯片疾病检测(如HIV、P53基因、结核杆菌)法医判定(如DNA指纹图谱)表示谱芯片肿瘤相关基因(正常与肿瘤组织表示差异)药品筛选(培养细胞药品刺激前后表示差异)发育(同一组织不一样发育时期基因表示差异)组织发生(不一样组织或器官基因表示差异)第11页依据工艺和载体1.原位合成法:密集程度高,可合成任意序列寡聚核苷酸,但特异性较差,寡聚核苷酸合成长度有限,且随长度增加,合成错误率增高。成本较高,设计和制造较烦琐费时。第12页 2.DNA微矩阵法:成本低,易操作,点样密度通常能满足需要。芯片载体需表面紧质、光滑
6、固体,如硅,陶,玻璃等,DNA微矩阵芯片惯用玻片为载体。第13页依据依据DNADNA成份成份寡聚核苷酸或DNA片段:约2025个核苷酸碱基,惯用于基因类型分析,如突变、正常变异(多态性)。全部或部分cDNA:约5005000个核苷酸碱基,通惯用于两种或以上样本相关基因表示分析。第14页基因芯片种类基因芯片种类Science Chip:生物分析和诊疗Nutri Chip:食物分析、转基因、污染检测Leuko Chip:血液分析、病毒分析、HLA分析Aqua Chip:水质分析Secure Chip:含DNA物质判定Chromo Chip:基因分析和染色体序列Prokaryo Chip:原核生物、
7、兽医、环境保护等第15页第十章第十章 生物芯片技术生物芯片技术第二节第二节 蛋白质芯片蛋白质芯片第一节第一节 DNA DNA芯片芯片第16页第一节第一节 DNA DNA芯片芯片第17页第一节第一节 DNA DNA芯片芯片DNA芯片技术包含四个主要步骤芯片设计与制备样品制备杂交反应和信号检测结果分析第18页生物芯片技术主要步骤生物芯片技术主要步骤芯片制备:微点阵芯片制备:微点阵样本制备:样本制备:DNADNA提纯、扩增、标识提纯、扩增、标识杂交:样本与互补模板形成双链杂交:样本与互补模板形成双链检测:共聚焦扫描,双色激光检测:共聚焦扫描,双色激光数据处理:定量软件,数据库检索,数据处理:定量软件
8、,数据库检索,RNARNA印迹等。印迹等。结果结果 第19页第一节第一节 DNA DNA芯片芯片第20页第一节第一节 DNA DNA芯片芯片 二、样品制备二、样品制备 三、杂交与结果分析三、杂交与结果分析 四、基因芯片技术在医学中应用四、基因芯片技术在医学中应用一、芯片制备一、芯片制备第21页一、芯片制备一、芯片制备基因芯片制备主要包含两个方面探针设计:依据应用目标不一样,设计不一样固定于芯片上探针。探针在芯片上布局:选择适当方式将探针排布在芯片上。第22页一、芯片制备一、芯片制备(二)(二)DNADNA芯片制备芯片制备(一)探针设计(一)探针设计第23页(一)探针设计(一)探针设计1.表示型
9、芯片探针设计 不需要知道待测样品中靶基因准确细节 序列特异性应放在首要位置 2.单核苷酸多态性检测芯片探针设计 等长移位设计法 3.特定突变位点探针设计 叠瓦式策略 一、芯片制备一、芯片制备第24页第25页一、芯片制备一、芯片制备 图102第26页(二)DNA芯片制备1载体选择与预处理 载体:用于连接、吸附或包埋各种生物分子并使其以固相化状态进行反应固相材料。载体材料:玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和聚丙烯膜等。载体化学处理:活化剂多聚赖氨酸 氨基硅烷偶联剂一、芯片制备一、芯片制备第27页2基因芯片制备(1)原位合成(in situ synthesis)光导原位合成法 原位喷印合成 分子印章
10、屡次压印合成(2)点样法 第28页芯片制备芯片制备原位合成法(in situ synthesis):又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适合用于寡核苷酸,使用光引导化学原位合成技术。是当前制造高密度寡核苷酸最为成功方法。第29页一、芯片制备一、芯片制备 图103第30页合成后交联(post-synthetic attachment):利用手工或自动点样装置将预先制备好寡核苷酸或cDNA样品点在经特殊处理过玻片或其它材料上。主要用于诊疗、检测病原体及其它特殊要求中、低密度芯片制备。第31页两种制备方法比较原位合成:测序、查明点突变 高密度、依据已知DNA编制程序 制作复杂、价格昂贵、不能
11、测定未知DNA序列合成后交联:比较分析 制备方式直接和简单,点样样品可事先纯化,交联方式多样,可设计和制备符合自己需要芯 片。中、低密度,样品浪费较多且制备前需储存 大量样品。第32页二、样品制备二、样品制备样品制备过程包含 核酸分子纯化、扩增和标识 第33页样本制备样本制备制备高质量样本是困难但又是极其主要。制备细胞、组织或整个器官样本应尤其小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成份等轻微改变都会使基因表示结果发生显著改变。用于基因类型分析样本是DNA,用于表示研究样本是cDNA。样本制备后应进行标识,通常为酶标识、荧光标识和核素标识。第34页三、杂交与结果分析三、杂交与结果分析(一)杂
12、交反应:与传统杂交方法类似(二)杂交信号检测:最惯用荧光法(三)数据分析:芯片杂交图谱处理与存放由专 门设计软件来完成。第35页杂交杂交是芯片技术中除方阵构建外最主要一步液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应。选择杂交条件时,必须满足检测时灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因,且能确保每条探针都能与互补模板杂交。适当长度DNA有利于与探针杂交。温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。最好在封闭循环条件下杂交,杂交炉。第36页结果分析结果分析 芯片与标识靶芯片与标识靶DNADNA或或RNARNA杂交后,或与标识靶抗杂交后,或与标识靶抗原或抗体结合后,可采取以下方法分析处理数原或抗体结合后
13、,可采取以下方法分析处理数据:据:共聚焦扫描仪:应用最广,重复性好但灵敏度共聚焦扫描仪:应用最广,重复性好但灵敏度较低。较低。质谱法:快速、准确,可准确判断是否存在基质谱法:快速、准确,可准确判断是否存在基因突变和准确判断突变基因序列位置。探针合因突变和准确判断突变基因序列位置。探针合成较复杂。成较复杂。化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电荷改变检测等。电荷改变检测等。第37页芯片扫读装置芯片扫读装置依据采取光电偶合器件,分为光电倍增管型和CCD型。依据激光光源,可分为激光型和非激光。应用最为广泛是激光光源共聚焦扫描装置,分辨率、灵敏度极高,有良好
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