新版生物分离技术自己整理的笔记.doc
《新版生物分离技术自己整理的笔记.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《新版生物分离技术自己整理的笔记.doc(30页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、分派系数m:式中,cs和cm分别为组份在固定相和流动相中的浓度。m类型:A、B型曲线是一条典型的吸附等温线,吸附色谱法属于这类曲线。C和D型吸附等温线很少碰到。C曲线为线性分派等温线。线性色谱:溶质浓度低时,m为常数时的色谱意义:容易理解,溶质流过色谱柱时,m大的组份通过色谱柱所需要的时间长,m小的组份需要的时间短;当样品中各组份在两相的m不同时,就能实现差速迁移,达成分离的目的。按原理分类(P122掌握)吸附等温线当吸附剂与溶液中的溶质达成平衡时,其吸附量q*同溶液中溶质的平衡应与温度有关。当温度一定期,吸附量只和浓度有关,q*=f(c)-吸附等温线。A)、Henrytype在一定温度下,平
2、衡时吸附剂吸附溶质浓度q*与液相溶质浓度c之间的关系为线性函数:m为分派系数。适应条件:在低浓度范围之内成立。当浓度较高时,上式无效。B)、Freundlichtype其经验公式为其中,k和为常数,一般在0.1-1之间。当吸附剂对溶质的吸附作用非常大的时候,也许小于0.1,此时游离浓度对吸附浓度的影响很小。Freundlich等温线可以描述大多数抗生素、类固醇、甾类激素等在溶液中的吸附过程。C)、Langmuirtype当吸附剂对溶质的吸附作用非常大时,这时存在0.1,或用前式表达Kb非常大,这时游离的溶质浓度对吸附浓度影响极小,接近不可逆吸附。D)、Rectangletype如在固定化单克隆
3、抗体的免疫亲和吸附中,一般存在0.1。1.塔板理论(platetheory)塔板理论的假设:(1)在每一个平衡过程间隔内,平衡可以迅速达成;(2)将载气看作成脉动(间歇)过程;(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略;(4)每次分派的分派系数相同。l n称为理论塔板数(theoreticalplatenumber)。与精馏塔同样,色谱柱的柱效随理论塔板数n的增长而增长,随塔板高H的增大而减小。n与半峰宽及峰底的关系式为:式中tr(或Y1/2)应采用同一单位(时间或距离)。上式示:在tR一定期,假如色谱峰越窄,则说明n越大,H越小,柱效能越高。l 在实际工作中,按上式计算出来的n和H值有时并不能充足地
4、反映色谱柱的分离效能,由于采用tR计算时,没有扣除死时间tM,所以,常用有效塔板数n有效表达柱效:有效塔板高为:例2已知一根1米长的色谱柱的有效塔板数为1600块,组份A在该柱上的调整保存时间为100秒,试求A峰的半峰宽及有效塔塔板高度。塔板理论的特点和局限性(1)当色谱柱长度一定期,塔板数n越大(塔板高度H越小),被测组分在柱内被分派的次数越多,柱效能则越高,所得色谱峰越窄。(2)不同物质在同一色谱柱上的分派系数不同,用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时,应指明测定物质。(3)柱效不能表达被分离组分的实际分离效果,当两组分的分派系数K相同时,无论该色谱柱的塔板数多大,都无法分离。
5、(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气(流动相)流速下柱效不同的实验结果,也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。l 速率方程(也称范.弟姆特方程式)-影响柱效的因素他们吸取了塔板理论中塔板高的概念,并同时考虑影响塔板高的动力学因素,指出:谱峰扩宽受三个动力学因素的控制,即涡流扩散,分子扩散项,传质阻力项。这样,上述塔板高方程表达H=A+B/u+CuH:理论塔板高度,u:载气的线速度(cm/s)l A涡流扩散项A=2dpdp:固定相的平均颗粒直径:固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小dp,填充的越均匀,A,H,柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻,色谱峰较窄。l B/u分子
6、扩散项B=2Dg:弯曲因子,填充柱色谱,1。Dg:试样组分分子在气相中的扩散系数(cm2s-1)(1)存在着浓度差,产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽,H(n),分离变差;(3)分子扩散项与流速有关,流速,滞留时间,扩散;(4)扩散系数:Dg(M载气)-1/2;M载气,B值。l Cu传质阻力项传质阻力涉及气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即:C=(Cg+CL)载气流速高时:传质阻力项是影响柱效的重要因素,流速,柱效。载气流速低时:分子扩散项成为影响柱效的重要因素,流速,柱效。l 速率理论的要点1)组分分子在柱内运营的多途径与涡流扩散、浓度梯度所导致的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分派平衡
7、不能瞬间达成等因素是导致色谱峰扩展柱效下降的重要因素。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素互相制约,如载气流速增大,分子扩散项的影响减小,使柱效提高,但同时传质阻力项的影响增大,又使柱效下降;柱温升高,有助于传质,但又加剧了分子扩散的影响,选择最佳条件,才干使柱效达成最高。分离度也称分辨度。它是指相邻两色谱保存值之差与两峰底宽平均值之比,即一般来说,当Rs1.5时,两峰才干完全分离。当然,更大的Rs值,分度效果会更好,但会延长分析时间。运用上式,可以直接从
8、色谱图上计算分离度。但该式没有体现影响分离度的诸因素。而下式清楚地指出了,分离度受柱效n、选择性和容量因子k三个参数的控制:意义:第一,增长塔板数,可以增长分离度,若通过增长柱长来增长塔板数,就会延长分析时间。所以,设法减少塔板高H,才是增大分离度的最佳方法。第二,加大容量因子可以增长分离度,但是会延长分析时间,至导致谱带检测困难。一般来说,当k10时,分离度的提高并不明显;而当k2时,即使在很短的时间内,组份也会完全分离。当a1时,要完毕分离,必须增长柱长,延长分析时间。例如,为了达成同样的分离度,当a=1.01时,所需的时间是a=1.1时的84倍。显然,当a=1时,无论如何提高柱效,加大容
9、量因子等,Rs均为零。在这种情况下,两组份的分离是不也许的。液相色谱l 凝胶色谱l 排阻极限(exclusionlimit)凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例如SephadexG50的排阻极限是30kD,即相对分子质量大于该数值的分子不能进入到凝胶网络中,其洗脱体积为V0。l sephadex葡聚糖凝胶G-25(50,75,100,100)的粒度的选择:组别分离时,选用孔径小的颗粒,虽然分辩率低,但由于组分的Kd值差异大,也能得到较好的分离。分级分离时,以孔径大的凝胶为主,并且规定颗粒大小均匀,以保证较高的分辩率。l 分子筛操作中的注意点 上样体积要足
10、够的小(一般为整个柱体积的15),样品中可以具有一定的盐成分(脱盐柱),柱子要有合适的长度。 洗脱一般为无梯度的洗脱。 针对分离的目的和样品的特性要选用不同特性的色谱柱(各个厂家会有说明其合用的分子量范围),以达成最佳的分离效果。 分子筛也常用来测定蛋白的亚基装配方式及全分子量的测定。缺陷优点操作简便回收率高分离条件温和应用广泛合用于生物大分子的初级分离,脱盐选择性低,料液解决量低产品被稀释脱盐生物大分子溶液的脱盐,以及除去其中的低相对分子质量物质。l 树脂类:Sephadex:交联葡聚糖Sepharose:琼脂糖凝胶Bio-GelA;Bio-GelP:聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl:
11、用N,N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶离子互换色谱(IEC)定义:运用离子互换剂为固定相,根据荷电溶质与离子互换剂之间静电互相作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。荷电溶质在离子互换剂上的分派系数:m(I)A/IBmI:流动相的离子强度;m:为离子强度无限大时溶质的分派系数,是静电互相作用以外的非特异性吸附引起的溶质在离子互换剂上的分派;常数A和B为pH的函数;B:溶质的静电荷数与离子互换基的离子价数之比。蛋白质为多价电解质,在pH偏离等电点的溶液中净电荷数常为两位数以上,故B值比较大。l IEC操作很少采用恒定洗脱法,而多采用线性梯度洗脱法、逐次洗脱法。l 离子互换层析的基本环节:平衡、上
12、样吸附、洗脱、再生1. 层析柱平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准,其中pH值最重要2. 样品进柱为了达成满意的分离效果,进样量一般为介质互换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高,样品浓度不宜太高l 样品总量不应超过柱的结合容量,上样体积一般无特殊的限制。缺陷优点IEC的操作变量远多于GFC,影响分离特性的因素非常复杂。解决量大,浓缩,高速;选择高,所需柱长较短;回收率高;离子互换剂种类多,价格也远低于亲和吸附剂。疏水性互相作用层析(HIC)定义:是运用表面偶联弱疏水性基团(疏水性配基)的
13、疏水性吸附剂为固定相,根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性互相作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。l 配基修饰密度过小则疏水性吸附作用局限性,密度过大则洗脱困难。l 疏水性互相作用层析的应用及特点1. 互补工具:HIC重要用于蛋白质类分离纯化,虽然HIC不如IEC的应用广泛,但可以作为IEC的互补工具。如方法得当,HIC与IEC的分离效率相称。2. 与盐析衔接:由于在高浓度盐溶液中疏水性较大,因此HIC可直接分离盐析后的蛋白质溶液。3. 可以通过调节疏水性配基链长和密度来控制吸附性能的大小,因此可根据目的产物的性质选择适当的吸附剂。4. 疏水性吸附的种类多,选择余地大,价格
14、与离子互换剂相称。反相层析(RPC)定义:运用非极性的反相介质为固定相,极性有机溶剂的水溶液为流动相,根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离纯化的洗脱层析法。l 前述HIC同样,RPC中溶质也通过疏水性互相作用分派于固定相表面,但是RPC固定相表面完全被非极性基团所覆盖,表现强烈的疏水性。因此,必须采用极性有机溶剂(如甲醇、乙氰等)或其水溶液进行溶质的洗脱分离。l RPC重要用于相对分子质量低于5000,特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化,也可用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性,并且流动相为低极性有机溶剂,生物活性大分子在RPC分离过程中容易变性失
15、活。所以,以回收生物活性蛋白质为目的时,应注意选用适宜的反相介质。l 因此RPC多采用减少流动相极性(水含量)的线性梯度洗脱法。l 分离能力:SECHICIECRPC使样品变性的趋势:SECIECHICRPC1. 液相色谱按分离机制分为那几大类?2. 简述柱层析系统的工艺流程。3. 何谓保存值、分派容量K、分离度?4. 何为理论塔板高度和理论塔板数?如何计算?5. 简述IEC的工作原理?6. 简述凝胶色谱的工作原理?7. IEC操作很少采用恒定洗脱法,而多采用线性梯度洗脱法(lineargradientelution)、逐次洗脱法(stepwiseelution),为什么?思考题1. 液相色谱
16、按分离机制分为那几大类?2. 简述柱层析系统的工艺流程。3. 何谓保存值、分派容量K、分离度?4. 何为理论塔板高度和理论塔板数?如何计算?5. 简述IEC的工作原理?6. 简述凝胶色谱的工作原理?7. IEC操作很少采用恒定洗脱法,而多采用线性梯度洗脱法(lineargradientelution)、逐次洗脱法(stepwiseelution),为什么?第二章发酵液预解决l 发酵液预解决目的1. 便于固液分离黏度大的悬浮液,不宜过滤目的产物在发酵液中的浓度通常较低成分复杂,固体粒子可压缩性大,悬浮物颗粒小,相对密度与液相相差不大2. 除去部分杂质和改变发酵液的过滤性能l 发酵液预解决的内容:
17、1. 发酵液杂质的去除,涉及除去蛋白质、无机离子、色素、热原、毒性物质等;2. 改善培养液的解决性能,重要是通过减少黏度、调节适宜的pH值和温度、絮凝和凝聚等操作来实现。无机离子的去除高价无机离子,如Ca2+、Mg2+、Fe3+等的存在,会影响离子互换树脂对生物活性物质的互换容量。1. 钙离子的去除 加入草酸,生成草酸钙,沉淀去除。 草酸与镁离子结合生成草酸镁,去除Mg2+ 草酸酸化发酵液,改变其胶体状态,有助于目的产物转入液相。 在用量大时,可用其可溶性盐。 反映生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固,提高滤液质量。2. 镁离子的去除 可加入三聚磷酸钠,形成络合物。 还可用磷酸盐解决,大大减少钙和镁
18、离子。3.铁离子的去除 一般用黄血盐去除,形成普鲁士蓝沉淀。可溶性蛋白质的去除 杂蛋白的存在,对分离纯化会产生三种影响 减少离子互换法和大网格树脂吸附法的树脂吸附能力 在用有机溶剂或双水相萃取时,会产生乳化现象; 常规过滤及膜过滤,会污染滤膜。 去除方法重要有:盐析法、等电点沉淀法、加热法、有机溶剂沉淀法、吸附法、其他沉淀法。盐析法水溶性蛋白质溶液是亲水胶体体系,其分子与水有很大的亲和力。水化层和双电层是胶体体系稳定的必要条件。离子半径小而带电荷较多的阴离子盐析效果比较好,含高价离子的盐比1-1价型盐的盐析效果好。硫酸铵是使用最普遍的盐,硫酸钠和氯化钠也常用于盐析。等电点沉淀法在等电点状态时,
19、所带电荷为0。处在等电点时,蛋白质分子之间的静电排斥力最小,使它失去了作为胶体体系稳定的基本因素,迅速结合成聚集体,极易沉淀析出。等电点沉淀一般在低离子强度和pH值约为等电点的条件下进行。等电点沉淀法一般多用于疏水性较大的蛋白质。与盐析沉淀法相比,等电点沉淀省去了后续的脱盐操作。有机溶剂沉淀法 有机溶剂的加入,使蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化限度减少,即破坏蛋白质胶体的水化膜,同时也可减少溶液的介电常数,导致蛋白质分子间的静电引力增大,产生凝聚和沉淀。 在低离子强度和等电点附近,较易生成沉淀,所需有机溶剂用量较少 蛋白质分子量越大,有机溶剂沉淀越易进行,所需有机溶剂用量越少 由于有机溶
20、剂易引起目的蛋白变性,沉淀必须在低温下进行。只合用于解决量较少的情况。吸附法 杂蛋白可以被某些吸附剂或沉淀剂吸附除去。 运用黄血盐和硫酸锌的协同作用,生成亚铁氰化锌钾胶状沉淀来吸附蛋白质,应用于四环素类抗生素的生产中。发酵液解决性能的改善1. 减少发酵液的黏度 减少液体黏度可提高过滤速率。 常用方法有加热法和加水稀释法。2.调节pH值 pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质,通过调节pH值可改善其过滤特性。3.絮凝采用细胞絮凝技术,可增大悬浮液中固体粒子的大小,提高其沉降速率,再结合其他的预解决方法减少发酵液黏度,就能采用普通过滤方法,简朴有效地实现固液分离。絮凝和凝聚的区别絮凝是指
21、在某些高分子絮凝剂存在下,基于架桥作用,使胶粒形成粗大的絮凝团的过程,是一种以物理的集合为主的过程。凝聚是指在中性盐作用下,由于双电层排斥电位的减少(或由于微粒所带电荷被加入的带有相反电荷的高价离子中和),而使胶体体系不稳定,微粒互相黏着在一起的现象。细胞絮凝的种类按是否添加絮凝剂分为两类:(1)自身絮凝酵母细胞产生絮凝,由细胞表面蛋白和酵母细胞外壁的甘露聚糖结合所引起。(2)絮凝剂絮凝:从化学结构看,重要分为三类:高聚物、无机盐、有机溶剂和表面活性剂。根据活性基团在水中解离情况,可分为非离子型、阴离子型(含羧基)和阳离子型(含胺基)。l 高聚物絮凝剂具有长链状的结构,运用长链上的活性基团,通
22、过静电引力,形成桥架连接,从而生成菌团沉淀。l 微生物絮凝剂:微生物在代谢过程中所分泌的特殊的高分子产物,能使液体中不易沉降的固体颗粒、菌体细胞及胶体粒子等凝集沉降。重要成分是多糖、糖蛋白、蛋白质和核酸。壳聚糖就是其中一种。l 蛋白质为主的絮凝剂对温度变化敏感,多糖组成的絮凝剂则热稳定好。絮凝机理与动力学絮凝机理:(1)胶体理论(2)高聚物架桥理论(3)双电层理论絮凝动力学 絮凝初期,颗粒聚并快,此时搅拌应剧烈些;絮凝后期,颗粒聚并速度变慢,搅拌速率应减少。 增长颗粒(细胞)的浓度,有助于聚并絮凝。 加大搅拌,增长速率梯度,有助于颗粒聚并;但搅拌速率过大时,剪切力会导致絮凝体破裂。絮凝的优化影
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 新版 生物 分离 技术 自己 整理 笔记
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【天****】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【天****】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。