组织工程中3D生物打印技术的应用.doc

组织工程中3D生物打印技术的应用

石 静，钟玉敏(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心影像诊断中心，上海市 200127)

文章亮点：
1 此问题的已知信息：3D生物打印技术是组织工程学的一个分支，可以实现组织、器官的体外构建。
2 文章增加的新信息：3D生物打印技术相较其他快速成型构建技术，具有独特的优势，是当前组织工程学及工程学研究的热点，但其仍面对较多难题，需要研究者进一步研究，其临床应用前景广泛，一旦未来在临床工作中全面铺开，具有划时代的意义。
3 临床应用的意义：3D生物打印技术能体外个性化复制患者或者生物医学所需要的组织、器官结构，具有仿生学价值，且能最小化排异反应，构建速度快，在临床科研实践中应用前景广泛。
关键词：
组织构建；组织工程；3D生物打印；组织工程学；快速成型技术；支架材料；选择性激光烧结；熔融沉积成型；立体光刻技术
主题词：
成像，三维；组织工程；支架；磁共振成像；计算机辅助设计

摘要
背景：近年来，研究者将最先应用于工程领域的3D打印技术嫁接到组织工程学中，希冀利用3D生物打印技术进行体外组织、器官复制过程，并取得了一些令人惊喜的成果。
目的：从3D打印技术的原理、打印操作步骤、与组织工程学的关系、优势和难题、临床应用等方面对其目前的发展趋势做一概述。
方法：第一作者应用计算机检索2000年1月至2013年10月PubMed数据库、中国期刊全文数据库、维普中文期刊网有关3D生物打印技术在组织工程中应用的文章，英文检索词“three-dimensional bioprinting, tissue engineering, rapid prototyping technology, scaffold materials, selective laser sintering, fused deposition modeling, stereolithography ”，中文检索词“3D生物打印，组织工程学，快速成型技术，支架材料，选择性激光烧结，熔融沉积成型，立体光刻技术”，排除重复性研究。共检索到79篇相关文献，其中52篇文献符合纳入标准。
结果与结论：3D生物打印就是借助影像技术(CT、MRI)资料的辅助，应用计算机辅助设计技术虚拟出待构建体的三维结构，然后利用相应的材料，逐层创建出实体的一种组织工程学技术。其具有高精度、构建速度快，可实现按需制造等优势，但也面对力学、生物学等方面的难题，临床应用前景广阔。

石静，钟玉敏. 组织工程中3D生物打印技术的应用[J].中国组织工程研究，2014，18(2):271-276.

Three-dimensional bioprinting technology in tissue engineering

Shi Jing, Zhong Yu-min (Center of Imaging Diagnosis, Shanghai Children’s Medical Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China)

石静，女，1982年生，江苏省苏州市人，汉族，上海交通大学医学院毕业，博士，主治医师，主要从事骨骼系统的影像学研究。

通讯作者：钟玉敏，上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心影像诊断中心，上海市 200127

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.
2014.02.018 [http://www.crter.org]

中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:2095-4344
(2014)02-00271-06
稿件接受：2013-11-06

Shi Jing, M.D., Attending physician, Center of Imaging Diagnosis, Shanghai Children’s Medical Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China

Corresponding author: Zhong Yu-min, Center of Imaging Diagnosis, Shanghai Children’s Medical Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China

Accepted: 2013-11-06

Abstract
BACKGROUND: Three-dimensional bioprinting technology is the emerging technology in recent years, which is one of the branches of tissue engineering. The three-dimensional bioprinting technology has been used in the reproduction process of in vitro tissues and organs, which has achieved surprising outcomes.
OBJECTIVE: To review the three-dimensional bioprinting technology in terms of its principles, operating steps, relationships with tissue engineering, advantages and challenges, as well as clinical applications.
METHODS: The first author did a computer-aided retrieval of the PubMed database, CNKI database, and CQVIP database for articles relevant to three-dimensional bioprinting technology used in tissue engineering published between January 2000 and October 2000. The key words were “three-dimensional bioprinting, tissue engineering, rapid prototyping technology, scaffold materials, selective laser sintering, fuseddeposition modeling, stereolithography” in English and Chinese. Repetitive studies were excluded, and 52 of 79 related literatures were adopted in result analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Three-dimensional bioprinting technology is one of the branches of tissue engineering, which can build a virtual three-dimensional structure layer by layer under the computer-aided design technology, with the help of imaging data information (including CT and MRI). This technology has the advantages of high precision, high building speed, fabrication on demand, and also has the challenges in engineering mechanics and biological activities. In a word, it is a meaningful and promising technology in clinical application.

Subject headings: imaging, three-dimensional; tissue engineering; stents; magnetic resonance imaging; computer-aided design

Shi J, Zhong YM. Three-dimensional bioprinting technology in tissue engineering. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(2):271-276.

0 引言 Introduction
组织工程学是20世纪80年代末开始发展起来的一门新兴科学，它涉及到临床医学、生物材料学、细胞生物学、分子生物学、生物工程等一系列学科的交叉融合，其目的主要是体内或体外生成可替代性的组织和器官，以修复受损害的组织、器官的功能[1-3]。黄洁夫曾在《柳叶刀》上发表文章称，中国每年大约有150万人因末期器官功能衰竭需要器官移植，但每年能够使用的器官数量不到1万，供求比例达到1∶150[4]。与此同时，中国需要接受器官移植的患者数量还在以每年超过10%的增量扩大。而组织工程学的进步或许会为这些患者提供生存的希望。近年来，研究者将最先应用于工程领域的3D打印技术嫁接到组织工程学中，希冀利用3D生物打印技术进行体外组织、器官复制过程[5-8]，并取得了一些令人惊喜的成果，现就3D生物打印技术在组织工程中的应用作一简单概述。

1 资料和方法 Data and methods
1.1 资料来源 第一作者应用计算机检索2000年1月至2013年10月PubMed数据库(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/pubmed/)、CNKI中国期刊全文数据库相关文章( com/)，英文检索词为“three-dimensional bioprinting, tissue engineering, rapid prototyping technology, scaffold materials, selective laser sintering, fuseddeposition modeling, stereolithography ”；中文检索词为“3D生物打印，组织工程学，快速成型技术，支架材料，选择性激光烧结，熔融沉积成型，立体光刻技术”。共检索到79篇相关文献，其中外文文献53篇，中文文献26篇。
1.2 纳入标准 ①文章所述内容需为组织工程学体外构建组织、器官的论著或综述类文章，以及与3D生物打印技术相关领域研究的成果报道或者未来应用领域探索相关的文章。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。
1.3 排除标准 重复性研究。
1.4 数据的提取 计算机初检得到79篇文献，阅读标题和摘要进行初筛，排除中英文文献重复报道和因观察对照内容、因素、目的不同、重复报道的病例，及文献内容与3D生物打印在组织工程学中的应用不相关的内容。
1.5 质量评估 符合纳入标准的52篇文献中，文献[1-8]是关于3D生物打印技术研究背景的相关报道，文献[9]是关于工业上已经成熟的3D打印技术，文献[10-34]是有关组织工程学构建及其相关各分支技术的相关报道，文献[35-44]是关于3D生物打印技术目前面对技术难题的相关报道，文献[45-50]是关于3D生物打印临床应用的相关报道，最后，文献[51-52]是关于3D生物打印技术定义的相关文献。

2 结果 Results
2.1 什么是3D打印 所谓3D打印是可以真实打印三维物体的一种技术[9]，其最早应用于工业制造领域，目前上海已经有3D打印实体店开张了。其打印原理简单来说类似于激光成型技术，采用分层加工、迭加成形的技术，即通过逐层增加材料来形成3D实体。称其为“打印机”是因为参照了目前商用打印机的技术原理，因为分层加工的过程与喷墨打印十分相似。3D打印机与传统喷墨打印机最大的不同在于：3D打印机的喷头不仅仅能在平面上移动，还能够垂直移动。它的打印过程类似于CT或者MRI扫描的逆过程，将一层层剖面图再重新叠加起来，从而构成三维结构。
实现3D打印的过程：首先在电脑中利用计算机辅助设计等技术建立产品模型，根据需要调整各种参数、如大小、各种生物分子的配比等，然后相关软件会自动将产品按照一定的厚度进行虚拟的“切片”，并将相关数据传输到3D打印机，打印机就把这些极薄的“切片”用塑料、松脂或金属粉末像打印彩绘图那样打印出来，然后通过可自由转动的喷嘴喷出堆接材料、强力胶水或聚焦光束将其黏合成一个整体。
打印过程涉及到所谓的“胶水”和“粉末”：在需要成型的区域喷洒一层特殊胶水，胶水液滴本身很小，且不易扩散，然后是喷洒一层均匀的粉末，粉末遇到胶水会迅速固化黏结，而没有胶水的区域仍保持松散状态。这样在一层胶水一层粉末的交替下，实体模型将会被“打印”成型，打印完毕后扫除松散的粉末即可“刨”出模型，而剩余粉末还可被循环利用。因此，打印耗材由传统的墨水、纸张转变为“胶水”、“粉末”，当然，此处所指的“胶水”、“粉末”都是经过处理的特殊材料，不仅对固化反应速度有要求，对于模型强度以及“打印”分辨率都有直接影响。
2.2 组织工程学的三维构建 经典的组织工程构建需要种子细胞和支架材料[10]。支架材料定义是：可以为种子细胞提供适合其生长的场所和发挥生物学功能的一种生物学材料，具有能模仿天然组织的构建性能[11]。作为种子细胞的生物学载体，理想的支架材料应具如下特 征[12-13]：①良好的生物相容性。②适中的生物降解性。③具有诱导或引导组织再生的能力。④具有一定的生物力学强度与可塑形性。⑤无毒性与无免疫原性。⑥具有合适的孔径，利于细胞黏附生长等特点。
早期的支架构建采用单纯的铸造技术，尽管可以形成多孔，但孔径的大小无法与细胞相匹配，无法根据计算机辅助成型技术事先确定支架内部结构及细胞与孔径间的连接。如今，最初用于制造业的模具开发和制造的快速成型技术解决了这一难题[14-17]。快速成型技术是多种三维构建技术的总称，又称为立体自由构建[18-22]，其方法主要是先利用计算机辅助成像技术虚拟构建出三维数字结构，再依此数字化模型，以逐层加工的模式逐步构建出所需的三维组织实体结构。以下简单介绍几种快速成型技术。
2.2.1 选择性激光烧结[23-26] 选择性激光烧结是使用激光发热将聚合物颗粒熔融烧结为所需的形状的一种生产制造技术。激光束扫描聚合物粉末，使局部表面温度升高，引起聚合物颗粒逐层烧结形成所设计的结构。选择性激光烧结的分辨率受到激光束直径的限制。改进选择性激光烧结加工工艺主要包括使用更小的激光束直径，更细的粉末，更薄的烧结层，从而生产出分辨率更高的支架，扩大支架的表面积，有利于细胞的生长。
2.2.2 熔融沉积成型[27-29] 熔融沉积成型是将热熔性材料加热熔化，通过喷头挤喷出来，随即与前一个层面熔结在一起，逐层沉积直至形成三维支架。该项技术的局限性在于其Z轴方向的运动有限，不利于三维构建，此外，用于熔融沉积成型的材料对其熔点和加工条件有较严苛的限制。
2.2.3 立体光刻技术[30-32] 立体光刻技术是以光敏树脂为原料，紫外激光器发射激光，在光树脂表面进行逐点扫描，使被扫描区域的树脂薄层发生光聚合反应而固化，形成一个薄层，一层固化完毕后，工作台下降一个凝固层的厚度，在原先固化好的树脂表面再敷上一层新的液态树脂，然后进行下一层的扫描加工，新固化的一层牢固地黏在前一层上，如此反复直到三维构建完成。其局限性在于细胞支架都是树脂类材料，不具有生物可降解性。
2.2.4 3D生物打印技术 以上几种立体自由构建技术，虽已取得了很好的效果，但其均不能够同时将细胞和支架材料同时构建为组织模型。而最初用于制造工业的打印设备为研究者提供了灵感：将打印机的墨水盒内按需装入配比好的混入种子细胞的液态材料，组成“生物墨水”，甚至可以依据彩色喷墨打印机具有不同颜色的墨盒槽的原理，选择不同的细胞、营养成分、支架材料等按不同配比装入不同的色槽，从而构成“彩色生物墨水”，实现按需的组织学装配。尽管生物大分子容易受到酸、碱、热等理化因素的因素发生变性，但有研究者已经成功地利用气泡打印机将DNA寡核苷酸链打印到玻璃表面形成微矩阵[33]，Boland领导的研究小组使用改装的普通喷墨打印机成功地将生物细胞打印到基质上，并先后完成了从细胞打印到器官打印的开创性研究[34]。
2.3 3D打印技术的优势和难题
2.3.1 3D打印技术相较其他快速成型技术，具有如下优势 ①高精度：即分辨率高。该技术可以精确控制墨水喷射位置和墨水的量，有利于生物显微结构的建立，有利于局部痕量供给生物活性因子及药物，从而有利于控制组织的局部生长发育。②可以同时打印种子细胞和支架材料，更利于整体三维结构的构建。其可以使用多颜色墨盒的原理，从而实现同时打印组织/器官内的不同组分，使用不同的细胞、细胞外基质和生物活性因子，并且使用精确的配比。③构建速度快：能够快速的制造生物组织/器官，保证了生物材料的存活率，从而显著有利于再生医药、器官移植等未来医学领域。④可以按需制造出符合个体需求的单个器官或组织，真正实现医学的个性化需求。⑤3D生物打印使用的种子细胞是来自患者自己身体的细胞，所以可以从根本上解决其他组织工程易发生的排异反应。
2.3.2 3D组织/器官打印技术尚处于起步阶段，还有很多问题需要解决 ①力学方面：喷射过程中的剪切力和液滴的冲击力会对打印细胞液活性造成冲击。因此，“生物墨水”的配制必须符合流体力学的要求，包括黏滞性、密度、表面张力等重要参数[35]。这些因素均可造成细胞的损失影响细胞的存活，从而不利于体外的培养。同时打印前，打印过程中均要求所打印的细胞或分子保持液态，而打印后又要求其必须立即凝固，以维持黏弹性状态。这种液态到固态的变化必须保证不引起细胞、生物活性因子以及其他微粒的损伤，这也对3D打印的发展提出了相当大的挑战。②生物支架材料：生物支架材料要解决的问题有：支架材料的可降解性及降解速率；材料的机械力学强度；支架的最适孔径和孔隙率[36-37]。适度的生物降解速率，指该降解速率需和组织再生的速率相匹配，最后可完全吸收或可安全排出。合适的孔尺寸、高的孔隙率(90%)和相连的孔形态，对于大量细胞的种植、细胞和组织的生长、细胞外基质的形成、氧气和营养的传输、代谢物的排泄以及血管和神经的内生长起着决定作用[38]。虽然，支架的最适孔径尚无定论，但学者还是公认，几十到几百微米的孔径对于细胞的迁移和长入支架内部通常认为是必需的[39]。支架孔径过小，不利于细胞的穿透，培养的细胞经过很长的时间，仍然依附于支架表面，未能穿透到支架内部。支架孔径过大，不利于细胞的黏附和铺展，同样会妨碍细胞生长。解决此问题的一个方法是用纳米纤维与微米纤维共同构建支架材料[40]。纳米纤维为细胞的黏附和生长提供合适的表面形态，利于细胞在支架上的黏附与生长，微米纤维提供整体的环境，利于细胞渗透到支架内部。所以微/纳米复合纤维支架应用于组织工程具有很大潜力[41]。目前国内外研究的支架材料种类众多，但归纳起来可分为两大种类：一类是天然生物衍生材料，如脱钙骨基质、壳聚糖、藻酸盐凝胶等；另一类是人工合成生物高分子材料，主要有羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃等无机材料和以聚乳酸及其共聚物等为代表的有机材料。这些支架材料都各有其优缺点，传统的支架往往是单一的有机物或无机物，但其往往不能同时满足3D打印的需要，因此，现在的研究方向是发挥不同材料的优势，弥补单一材料的不足，制造出各种复合支架材料。③生物学方面：3D打印过程中必须优先考虑的问题就是如何保持细胞的活力以及产品的塑形[42-44]。组织/器官打印必须处理好的几个生物学问题包括：A.所选择的打印方法对细胞和DNA既无毒性，也不会引起不可逆的损伤，在整个打印过程中都要求是无菌化的。B.打印的构建物可以快速成型，成为有凝聚性的、具有机械稳定性的三维结构，不能在打印后出现溶解或坍塌。C.打印的构建物可以进行体外培养、增殖、分化、发育等后处理过程，要求构建模型是具有组织/器官三维特征的，能够模拟组 织/器官特异性的微结构和微环境。D.构建的组织/器官的再血管化问题也非常关键，它是构建组织/器官成活的关键，血管可以及时为种子细胞提供其成活所必需的营养，并且可以排泄代谢废物。
2.4 3D生物打印技术的临床应用
2.4.1 人造毛细血管 德国的Gunter Tovar博士已经利用3D打印技术制造出人工血管[45]。虽然早在20世纪50年代，人造血管就已经被研制成功，但仅限于大动脉血管，对于直径在6 mm以下的静脉血管或者毛细血管的研究上，一直没有取得突破性进展。主要原因是，人造毛细血管不仅需要足够细小，而且还要有能和真实血管媲美的弹性和生物相容性。德国科学家用3D打印双光子聚合和生物功能化修饰制作出的毛细血管，具有良好的弹性和人体相容性，不但可以用于替换坏死的血管，还能与人造器官结合，有可能使构造的组织/器官实现再血管化。
2.4.2 人造骨骼 人体骨骼形态极不规则，个体形态 差异较大，因此，成批制造人工骨骼意义不大，而个性化定制人工骨骼在临床应用中有广泛需求。
瑞士伯恩塞尔医院的Christian Weinand领导的研究小组成功复制了他自己的拇指骨[46]。解放军第三军医大学西南医院关节研究中心已经拥有自己的立体打印骨骼的三维打印机。该科王富友博士用其打印了教学实体器官，还用打印出来的“人造器官”为患者讲解手术方案，未来有望用于人体实验。
3D打印用于人工骨的构建时，根据使用材料的不同，可以分为3种工艺：①黏结材料三维打印所用喷头大多为压电式喷头，易造成喷嘴阻塞，且其黏结剂的添加会影响骨骼材料的生物活性，因此，该技术不能应用于成形人体骨骼。②光敏材料三维打印运动方式最为简单，喷头选择性地喷出实体材料和支撑材料，可在室温下操作，是理想的骨骼打印方法，其局限性在于当前广泛用于骨骼构造的生物材料是羟基磷灰石，其自身不是光敏材料，所以必需与光敏材料混合使用，从而影响了骨骼的生物活性。③熔融材料三维打印成形，可采用由磷灰石和骨骼所需的有机盐配置而成的骨水泥，不需要添加黏合剂或光敏介质，有利于维持细胞的活性；由螺杆挤压式喷头喷射成形，不会造成阻塞现象；不需要紫外光照射固化，只需要惰性气体迅速冷却即可，使其可在室温下操作。因此，该技术成为人体骨骼3D成形领域的主导方向。上海交通大学、西安交通大学、清华大学的研究者们在此技术上均取得了不同程度的成 果[47-49]。
2.4.3 口腔医学 类似于人体骨骼，牙齿的形态、结构亦相当复杂，组织结构构成多样，为了适应牙槽的结构，牙齿生长及发展变化的趋势亦完全不同，因此，用传统的组织工程技术进行牙再生存在众多难以解决的问题。而三维生物打印技术是可以进行计算机辅助成型技术设计的，以满足个性化生产的需求，因此，三维打印技术在口腔医学也有着广泛的应用。
北京大学口腔医学院薛世华等[50]已经成功进行了人牙髓细胞共混物的三维生物打印。该课题组采用酶联合消化法原代培养人牙髓细胞作为种子细胞，海藻酸 钠-明胶水溶胶作为支架材料，进行三维打印。打印后，将获得的三维生物打印结构体浸入完全培养基进行后加工培养。经评测，打印后的细胞体存活率可达(87±2)%。该研究表明生物打印技术在人牙齿组织工程中应用的可行性，未来有望应用于牙再生工程。
据百度网页新闻搜索得知，Objet公司与3Shape公司日前宣布，两家公司已合作研发出牙科领域的三维修复方案。此方案将Objet Eden系列三维打印机与3Shape Dental System 2010进行无缝整合，完成牙科领域的三维修复设计和三维原型制作。它涵盖了从三维印模扫描、应用3Shape Dental System完成计算机辅助成型设计、运用3Shape CAM bridge专属CAM软件编辑/修复三维数据，直至在Objet Eden系列三维打印机上完成最终生产和制作等一系列的工作流程。

3 讨论 Discussion
组织工程学经过近30余年的发展，已经取得了长足的进步，从早期的静态培养模式，到后来应用生物反应器促进细胞生长[3]。近年来，研究者越来越重视细胞局部微环境和组织局部微结构对细胞生长、发育的影响，促使研究者利用仿生学等原理，着眼于体外构建适合组织细胞生长的显微结构，尽可能地模拟体内环境，从而协调不同细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等。因此，组织工程学的关键在于构建一个能够维持细胞活力、利于细胞营养输送的三维微环境，并且该微环境能够提供足够的机械强度，便于不同细胞间的信号传导[51]。
组织工程构建最关键的原材料是种子细胞和支架材料，而最初用于制造工业的快速成型技术将二者可以融合起来以完成三维构建目的。快速成型技术是多种三维构建技术的总称，包括选择性激光烧结、熔融沉积成型、立体光刻技术以及3D生物打印技术。因此，3D生物打印技术是组织工程学构建的一个分支学科。
归纳起来，3D生物打印就是借助影像技术(CT、MRI)资料的辅助，应用CAD技术虚拟出组织或器官的三维结构，然后将这些三维实体模型数据分为片层模型数据，快速成型机根据这些数据，利用相应的材料，逐层创建出实体，每一个薄层都贴敷到前一个，直到完成整个实体的构建[52]。因此，3D打印可以分为3个基本步骤：前加工即组织/器官模型文件的设计开发；组织/器官的打印；后处理即拥有生物活性和形态的组织/器官的加工成熟(即增殖)。
比起其他组织工程学的体外构建技术，3D生物打印技术具有精度高、构建速度快、可按需制作，以满足个体化医学治疗的需求、排异反应低等优势。同时也面临不小的挑战，包括生物力学方面、支架材料的选择、无菌环境的保证、打印构建物的成型、打印构建物的血供、打印构建物的长期存活等。因此，3D生物打印技术目前还不是一项完全成熟的技术，还需要研究者的不懈努力及攻关，目前还未能广泛应用于临床。
尽管如此，国内外不少研究中心及实验室已经广泛进行了3D生物打印技术的临床实验，其最多应用于骨与软骨组织工程，另外在口腔医学、美容医学等各个临床领域也都开花结果。
总之，三维生物打印技术是组织工程学三维立体结构构建技术中的一种，其有广泛的应用前景，是当前生命科学领域、材料学领域、工程学领域、药学领域等多学科研究的热点。如果“生物打印”技术成熟，也许在未来的几十年间，人体器官就能够被随时替换，从而延长人类的生命周期。但其未来发展的路还很遥远，它的发展，它所面临的问题，必然需要各学科的共同努力，需要各学科的整合，各学科的突破，才能够最终实现。

致谢：感谢通讯作者的鼎力支持，感谢家人在工作上的理解和支持。
作者贡献：第一作者和通讯作者构思并设计综述，分析并解析数据，2位作者共同起草，经通讯作者审校，第一作者对文章负责。
利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。
伦理要求：无涉及伦理冲突的内容。
学术术语：RP技术-即快速成型技术，是多种三维构建技术的总称，又称为立体自由构建。其方法主要是先利用计算机辅助成像技术虚拟构建出三维数字结构，再依此数字化模型，以逐层加工的模式逐步构建出所需的三维组织实体结构。
作者声明：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和专利争议，内容及数据真实，文责自负。

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