基于网络药理学和分子对接技...后应激障碍焦虑样行为的机制_张峥嵘.pdf
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1、基于网络药理学和分子对接技术研究安神定志方干预创伤后应激障碍焦虑样行为的机制张峥嵘,高峰,杨绍杰,王训翠,姬曼曼,朱国旗(安徽中医药大学新安医学教育部重点实验室,安徽 合肥 )摘要 目的采用网络药理学方法和分子对接技术探讨安神定志方(,)干预创伤后应激障碍(,)的作用机制。方法使用 、等筛选 的有效成分及靶点,借助 和 等数据库收集 靶点;将 成分靶点与 疾病靶点取交集靶点;通过 数据库构建靶点互作网络筛选核心靶点;对交集靶点进行 功能分析和 富集分析,构建“中药成分靶点通路”网络;选取疾病关键靶点与 主要活性成分进行分子对接,并开展动物实验验证。结果 防治 的网络中共有 个活性成分、个交集靶
2、点、个关键靶点、个生物过程、个细胞组分、个分子功能。对 、与 关键活性成分进行分子对接,结果显示具有较好的结合活性。在动物实验中,与正常对照组比较,可明显改善 的焦虑样行为与突触功能,同时增加 蛋白的表达水平。结论 治疗 可能通过调控 信号通路影响突触能传递、钙信号转导、蛋白合成等发挥作用。关键词 安神定志方;创伤后应激障碍;网络药理学;分子对接;机制研究 中图分类号 创伤后应激障碍(,)是指一个人暴露于极端的压力或者经历创伤事件后出现的严重心理创伤。目前对 的治疗仍以心理干预为主,临床治疗远低于预期,故寻找有效治疗 药物仍是巨大挑战。属于情志病,主要由惊恐所致,惊恐扰乱心神而致心气虚,过恐而
3、致肾精不足。安神定志方(,)是 医学心悟 中记载的新安医学名方,由茯苓、茯神、人参、远志、石菖蒲、龙齿组成,有安神定志、益气镇惊之功效。方中茯苓治惊悸、心神不安;茯神安魂魄以养神;人参补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸;远志强志而益智,石菖蒲开心窍以补五脏;龙齿可镇静安神而解心下结气。诸药同用,可使神志安定、心肾皆宁,故曰“安神定志”。安徽中医药大学第一附属医院在 的治疗上积累了丰富的临床经验,运用安神定志丸加减联合草酸艾司西酞普兰片治疗 的效果显著。前期项目组评价了 对 的干预作用,但其药效物质与作用机制尚不清楚。本研究拟运用网络药理学结合分子对接技术和基金项目:国家自然科学基金项目();安徽省
4、重点研究与开发计划项目();安徽省高等学校自然科学研究重点项目()作者简介:张峥嵘(),女,硕士,助理研究员通信作者:朱国旗(),男,博士,研究员,博士研究生导师,实验验证,研究 治疗 的活性成分、靶点、通路及生物过程,旨在阐明该方的药效物质及作用机制,为临床运用提供参考。材料与方法 活性成分筛选通过中药系统药理数据库 、数据库平台,以口服生物利用度、药物相似性 作为筛选条件,结合文献挖掘与整理,获得 的潜在活性成分。靶点预测将筛选的有效成分结构导入到 平台,限定物种为 ,预测 活性成分中的潜在蛋白质靶点,选取前 位靶点中 的靶点为有效成分潜在靶点,并建立靶点数据库。治疗 潜在靶点收集应用 、
5、和 数据库以“”为关键词检索 疾病靶点。合并个数据库结果并去除重复后作为 相关靶点。将疾病相关靶点与活性成分作用靶点取交集,将交集靶点视为复方治疗疾病的潜在靶点。网络构建及核心靶点筛选在 数据库中导入潜在靶点,选择 ,物种选择 ,设定最低相互作用阈值为,建立 网络。和 富集分析在 数据库中导入筛选的核心靶点,选择物种为 :安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 ,并将靶点基因校准为 ,然后进行生物分子功能富集分析和 通路富集分析。“药物成分靶点通络”网络的构建基于对 相关通路的筛选结果,统计相关通路中涉及的靶点,以及靶点对应的成分。将整理的结果导入 软件中,以度值大小构建网络,并筛选出 核心活
6、性成分、核心靶点和核心通路。分 子 对 接选 取 核 心 活 性 成 分,用 进行结构优化,保存能量最低的优势构象的 格式,在 软件中导出为 格式,设为配体;通过 数据库获得排名靠前的靶蛋白的 格式文件,导入 软件输入“”“”命令进行去水和去小分子配体处理,再在 软件中加氢,导出为 格式,设为受体。使用 将配体与受体进行对接,取结合力最高的构象用 软件进行分析作图。实验动物 只雄性 小鼠(体质量为 ,月龄),实验动物购于安徽医科大学实验动物中心 生产许可证号 (皖)。饲养于温度()、相对湿度 的动物房中,光照条件设置为 的明暗循环,小鼠可随意饮水和摄食。实验经安徽中医药大学动 物 伦 理 委
7、员 会 批 准,伦 理 编 号:。的制备 由茯苓、茯神、人参、远志各,石菖蒲、龙齿各 组成,购于安徽中医药大学第一附属医院。每剂用 倍量蒸馏水浸泡 ,煮沸后维持微沸状态 ,用纱布滤出滤液;再用蒸馏水煮沸后保持微沸 ,依上法滤出滤液。将次滤液合并放入旋转蒸发仪,减压浓缩后冷冻干燥成 水提物冻干粉(干粉相当于 药 材 量),低 温 干 燥 条 件 下 保 存备用。模型制备与给药 小鼠适应周后 建 立 单 次 延 长 应 激(,)模型。实验流程如下:束缚、强迫游泳 、休息 后,用异氟烷麻醉,足部电击(,)。模型复制完成后,将 只小鼠随机分为组():正常对照组、模型组、组。组小鼠灌胃给药 (),正常对
8、照组和模型组均给予等量生理盐水。每日定时给药次,连续给药。在最后天给药后对小鼠进行行为学测试。()旷场实验将待测小鼠放入旷场测试装置中心区,安静环境下观察小鼠 内的自发活动,使用行为学自动分析系统(上海欣软信息科技)比较各组之间运动的总路程、进入中央区域的次数及运动总路程。()高架十字迷宫实验将小鼠放置于中央区域面对开放臂的方向,安静环境下小鼠自由探索。采用行为学自动分析系统(上海欣软信息科技)记录小鼠 内进入开臂、闭臂的滞留时间百分比。透射电子显微镜观察海马突触、神经元超微结构将海马组织从 戊二醛溶液中取出,经过 冲洗后,用锇酸固定,并经过梯度乙醇脱水,树脂浸透,包埋,切片(),铀染、铅染处
9、理,透射电子显微镜下观察海马神经元、髓鞘超微结构及突触和突触小泡的数量。法检测、通路蛋白的表达水平将取材的小鼠海马组织置于 管中,加入 裂解液,组织匀浆,、离心 ,取上清。测定蛋白浓度,分离蛋白质样品,转膜,室温下用脱脂牛奶封闭,洗膜后加 入(,)和 一抗(,),过夜。对应的二抗孵育。洗膜,显色液显影成像。采用 软件进行数据分析。统计学方法测量数据采用“均数标准差(?)”表示,以 软件采用单因素方差分析用于组间比较。.表示差异有统计学意义。结果 的潜在活性成分从 、个中医药数据库中搜集到 中 个候选化合物,然后通过 平台以候选化合物的口服生物利用度和类药性为指标,共筛选出 中活性成分 个,其中
10、茯苓个、茯神个、人参 个、石菖蒲 个、远志 个、龙齿个。去重后最终得到 活性成分 个。部分有效成分见表。活性成分作用靶点通过 预测活性成分作用靶点,以 为指标,筛选去除重复后得到 个活性成分作用靶点。其中人参 个、石菖蒲 个、远志 个、茯苓 个、龙齿 个、茯神 个。治疗 的潜在靶点通过 、数据库检索、筛查并去除重 :安徽中医药大学学报 第 卷 第期 年月 表 部分活性成分序号本草编号活性成分相对分子质量来源 山柰酚 人参、石菖蒲 啤酒甾醇 茯苓 ,二甲氧基酮 茯苓 去甲头孢拉酮 远志 去甲莨菪碱 远志 远志酮 远志 胡椒内酰胺 远志 甲氧基藤黄菌素 人参 阿朴天仙子碱 人参 蛇藤苄酰胺 人参复
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