马疱疹病毒8型gD蛋白的生物信息学分析及多克隆抗体制备.pdf

动物医学进展,():P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e马疱疹病毒型g D蛋白的生物信息学分析及多克隆抗体制备收稿日期:基金项目:聊城大学大学生创新项目(C X C Y ,C X C Y ,C Y C X );国家自然科学基金();山东省自然科学基金(Z R Q C ,Z R Q C )作者简介:徐萌(),女,甘肃兰州人,硕士研究生,主要从事动物医学研究;郗灿坤(),女,山东泰安人,动物医学专业本科生.同等贡献作者.通讯作者徐萌,郗灿坤,王天娇,李瑞博,丁相丹,孙祺,胡乐玉,任慧英,李亮亮,王彤彤(聊城大学毛驴高效繁育与生态饲养研究院,山东聊城 ;青岛农业大学动物医学院,山东青岛 )摘要:旨在探索马疱疹病毒型(E q u i n eh e r p e s v i r u st y p e,EHV )囊膜蛋白g D的生物信息学特性、原核表达和多克隆抗体制备.用生物信息学分析软件对g D基因编码蛋白质的理化性质、亲/疏水性和跨膜区进行分析,以EHV S D L C 毒株为模板,通过P C R扩增g D蛋白的胞外区并克隆至p E T a()载体中,将重组质粒p E T a g D转化至B L (D E)中,经I P T G诱导表达后,收集菌体超声破碎,纯化并获得重组g D蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,用间接E L I S A测定所制备多克隆抗体的效价,同时用W e s t e r nb l o t与间接免疫荧光试验(I F A)明确所制备多克隆抗体的特异性.结果表明,EHV g D编码的蛋白稳定,是亲水性蛋白,有跨膜区,位于 a a.g D蛋白跨膜区正确克隆入p E T a()载体,获得重组质粒p E T a g D.重组g D蛋白在大肠埃希氏菌B L (D E)中以包涵体形式表达,分子质量约为 k u,将其纯化后免疫新西兰兔获得抗g D多克隆抗体,该抗体的效价高达 ,W e s t e r nb l o t与I F A结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性.关键词:马疱疹病毒型;囊膜蛋白g D;生物信息学分析;多克隆抗体;原核表达中图分类号:S 文献标识码:A文章编号:()马疱疹病毒型(E q u i n eh e r p e s v i r u st y p e,EHV )又称驴疱疹病毒型(A s i n i n eh e r p e s v i r u st y p e,AHV ),属 疱疹病毒亚科,感染马属动物后引起急性呼吸道疾病、流产和脑脊髓炎等.EHV 基因组全长约 k b,包含 个开放阅读框,可编码 种蛋白.年在我国东北地区发热马分离到株EHV w h毒株 .年在公驴体内分离到EHV /毒株.作者从病死驴的肺脏、流产病料及脑组织中能够分离到多株EHV 野毒株 .EHV 是导致驴呼吸道疾病、孕驴流产、弱驹以及病毒性脑炎的主要致病原.为了解EHV 感染情况,围绕山东省、河南省、河北省的规模化驴场和屠宰场采集驴血样展开流行病学调查,发现阳性率高达(/),提示当前驴场EHV 的感染比较严重.g D蛋白作为EHV 的囊膜蛋白,由O R F 基因编码,g D蛋白在结合宿主细胞表面受体和病毒入侵过程中起关键作用 .EHV /的g D蛋白是诱导宿主产生中和抗体最主要的蛋白之一,能够在感染的马体内产生特异性的中和抗体,并诱导强烈的保护反应 .研究发现原核表达的g D蛋白也能够诱导小鼠产生中和抗体,对EHV 感染具有一定的保护作用.因此,研究g D蛋白在EHV 感染过程中的作用有重要意义.国内外尚无EHV g D蛋白抗体的报道.本文用生物信息学软件分析g D蛋白的特性,将g D蛋白的胞外域克隆至p E T a()载体中,通过原核表达获取重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体.E L I S A、W e s t e r nb l o t和间接免疫荧光试验均证实该抗体可特异性识别g D蛋白,为今后该病毒检测方法的建立和病毒复制特性、免疫机制的研究奠定了基础.材料与方法材料毒株、感受态细胞、质粒EHV 分离毒株S D L C (G e n B a n k登录号:MW )以及R K 细胞、DH 感受态细胞、B L (D E)感受态细胞、原核表达载体p E T a()均由聊城大学毛驴高效繁育与生态饲养研究院保存.主要试剂病毒D NA提取试剂盒、通用型D NA纯化回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒,天根生化科技 有限公司产 品;S D S P AG E L o a d i n gB u f f e r、彩色预染蛋白分子质量标准、M D L p l u sD NA M a r k e r,宝生物工程(大连)有限公司产品;限制性内切酶B a mH、H i nd、T D NA连接酶,N e wE n g l a n dB i o l a b s公司产品;B C A蛋白定量试剂盒,赛默飞世尔公司产品;过氧化物酶(HR P)标记羊抗兔I g G、C y 标记羊抗兔I g G和细胞核染液D A P I,索莱宝生物科技有限公司产品.实验动物月龄健康新西兰雌性大白兔只,购自济南西岭角生物科技有限公司.方法生物信息学分析用理化性质预测在线软件E x P A S y的P r o t P a r a m程序分析g D蛋白的理化性质;用跨膜区预测在线程序TMHMM分析g D蛋白跨膜区;用亲疏水性在线程序P r o t S c a l e分析g D蛋白的亲/疏水性.EHV g D蛋白引物的设计与合成针对g D蛋白的胞外区(a a)设计特异性引物,并在上、下游引物的 端分别引入B a mH和H i nd的识别位点,片段预期大小为 b p,引物由北京六合华大基因科技有限公司合成(表).表引物序列T a b l eP r i m e r s e q u e n c e s引物名称P r i m e rn a m e引物序列P r i m e r s e q u e n c e产物长度/b pP r o d u c t l e n g t hg D Fg D R C G G GA T C C GA GAAA T T C AA G C G C G C C C AA G C T T T G G G T C T G T T T T A T T T T b pEHV g D基因的扩增利用病毒D NA提取试剂盒获取EHV S D L C 毒株的D NA,并利用上述引物对g D蛋白的胞外区域进行序列扩增,P C R体系 L:Q H i g h F i d e l i t yM a s t e rM i x L,上、下游物各L,D NA模板L,d d HO补至 L.P C R反应条件:s;s,s,s,个循环;终延伸m i n.获得的P C R产物经 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,利用D NA片段纯化回收试剂盒对目的条带进行胶回收.重组表达质粒的构建与鉴定将EHV g D基因胶 回 收 产 物 和p E T a()载 体 分 别 利 用B a mH和H i nd在 条件下双酶 切,经 g/L琼脂糖凝胶电泳分析后,借助D NA胶回收试剂盒进行回收,将片段和载体通过T D NA连接酶连接,将连接产物转化至DH 感受态,并涂布于含有氨苄青霉素的L B固体平板.次日挑取单克隆菌落进行菌液P C R检测,筛选出阳性菌进行扩大培养.利用质粒提取试剂盒获得重组质粒p E T a g D.经双酶切鉴定后,送至华大基因有限公司进行基因测序鉴定.重组EHV g D蛋白的诱导表达与可溶分析将 测 序 正 确 的 重 组 质 粒p E T a g D转 化B L (D E)感受态,挑取单克隆菌落加入氨苄青霉素的L B培养基,、r/m i n过夜培养.次日将菌液按 的比例接种至新鲜氨苄青霉素L B液体培养基中培养.待菌液O D n m的光密度值为时,加入终浓度为mm o l/LI P T G,诱导 h.离心收集菌体加入P B S重悬后,借助超声波破碎仪裂解菌体(破碎s,间歇s,设置时间 m i n),离心后分别取上清和沉淀进行S D S P AG E分析,以确定重组蛋白的可溶性.重组g D蛋白纯化用b u f f e rA溶液(mm o l/LN a HP O,mm o l/LT r i s HC l,m o l/L尿素)充分溶解g D蛋白沉淀,m滤膜过滤后,取上 清 结 合N I柱 纯 化,用b u f f e rB溶 液(mm o l/L N a HP O,mm o l/L T r i s HC l,mm o l/L咪唑,m o l/L尿素)去除杂蛋白,用b u f f e rC溶液(mm o l/L N a HP O,mm o l/L T r i s C l,mm o l/L咪唑,m o l/L尿素)洗脱目的蛋白,最后借助B r a d f o r d法测定蛋白浓度.重组g D蛋白多克隆抗体的制备免疫前采集 m L兔血液分离血清作为阴性对照,将纯化的重组g D蛋白借助不同浓度尿素(、m o l/L)溶液逐步复性,利用B C A试剂盒测定蛋白浓度,初次免疫将重组g D蛋白与等体积弗氏完全佐剂充分乳化后在兔子背部皮下分多点注射,免疫剂量为m g/只);免疫周后,取g D蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化,免疫剂量为 g/只.每周加强免疫次,先后免疫次,最后安乐死实验兔收集血液,分离血清,冻存备用.重组蛋白EHV g D多克隆抗体效价测定借助间接E L I S A方法测定多克隆抗体的效价,以纯化的重组EHV g D蛋白(n g/孔)作为抗原包被 孔板,孵育过夜.用P B S T(含 m L/LT w e e n 的P B S)洗涤次,m i n/次,加入含 m L/LB S A的P B S T L/孔,封 闭h;P B S T洗涤次,将g D蛋白多克隆抗体按照不同比例稀释后分别加入 孔板中,每个稀释度设置个重复,同时设置免疫前血清作为阴性对照,孵育动物医学进展 年第 卷第期(总第 期)h;P B S T洗涤次,再将HR P标记的山羊抗兔I g G加入 孔板中,孵育h,P B S T洗涤次后,加入TMB(L/孔),室温避光孵育 m i n进行显色,加入m o l/LHS O(L/孔)终止显色反应,借助酶标仪读取O D n m处的光密度值,分析数据后,绘制图表.W e s t e r nb l o t分析将R K 细胞铺入孔板(个/孔),接 种EHV S D L C 毒 株MO I,待出现典型细胞病变(C P E)后,收集细胞,利用蛋白质裂解液裂解后离心收集上清,加入S D SP AG EL o a d i n gb u f f e r沸水浴中煮 m i n.取 L进行S D S P AG E电泳,转P V D F膜,转膜后用 g/L脱脂奶粉置室温封闭h,m L/LB S A 稀释多克隆抗体作为一抗,置于过夜孵育.P B S T洗涤次,每次m i n,加入HR P标记的山羊抗兔I g G稀释液(),室温孵育h,P B S T洗涤次,m i n/次,经E C L化学发光液显色后拍照记录.间接免疫荧光分析将细胞爬片铺入 孔细胞板后,接种R K 细胞(个/孔),待细胞汇 合 度 达 ,接 种EHV S D L C MO I,同时设置未接毒细胞作为阴性对照,待细胞出现C P E,用预冷的 m L/L酒精固定细胞 m i n;P B S洗次,每次m i n,用g D蛋白多克隆抗体按照 稀释作为一抗,P B S洗涤后,加入C y 标记的羊抗兔I g G进行孵育.用含D A P I的抗荧光淬灭封片剂封片,置于倒置荧光显微镜下观察,并拍照留存.结果EHV g D蛋白生物信息学分析理化性质预测EHV g D蛋白包含 个氨基酸组成,其分子式为C H N O S,分子质量 k u,理论等电点(p I)为,偏碱性.预测不稳定系数为 ,证明g D编码蛋白稳定;理论半衰期在体外哺乳动物网织红细胞中为 h,在酵母内 h且在大肠埃希氏菌内 h.另外,其亲水性平均值(G R AVY)为 ,说明g D蛋白为亲水性蛋白.亲/疏水性预测用E x P A S y中P r o t S c a l e程序对g D蛋白进行亲/疏水性分析,结果显示第 位氨基酸处有最大疏水值为 ,第 位氨基酸处有最小亲水值为 (图),即g D蛋白为亲水性蛋白.跨膜区分析对g D蛋白跨膜结构域预测显示,g D为二次跨膜蛋白,分别位于 a a和 a a,本研究选取g D蛋白的胞外区域 a a进行原核表达.图EHV g D蛋白亲/疏水性预测F i g H y d r o p h i l i c i t ya n dh y d r o p h o b i c i t yp r e d i c t i o no fEHV g Dp r o t e i n胞内区(a a,a a);跨膜 区(a a,a a);胞 外 区(a a)I n s i d er e g i o n(a a,a a);t r a n s m e m b e rr e g i o n(a a,a a);o u t s i d er e g i o n(a a)图EHV g D蛋白跨膜结构域预测F i g T h e t r a n s m e m b r a n ed o m a i np r e d i c t i o no fEHV g Dp r o t e i n重组表达质粒的构建与鉴定以S D L C 毒株为模板,利用特异性引物对g D蛋白的胞外区(a a)进行P C R扩增,片段大小为 b p,与预期大小一致(图).将获得的片段克隆到p E T a()载体中,命名为p E T a g D.重组质粒经B a mH和H i nd进行酶切鉴定,目的片段和载体大小与预期一致(图),提示重组质粒p E T a g D构建成功.重组EHV g D蛋白诱导表达与可溶性分析将重组质粒p E T a g D转入B L (D E),经mm o l/LI P T G诱导后,S D S P AG E分析发现,重组g D蛋白以沉淀的形式存在(图).菌体沉淀经m o l/L尿素溶解后,借助N i柱纯化g D蛋白,S D S P AG E分析纯化后的融合蛋白大小约 k u(图),经过蛋白浓度测定试剂盒确定样品的浓度为m g/m L.徐萌等:马疱疹病毒型g D蛋白的生物信息学分析及多克隆抗体制备MD NA标准D L ;g D(a a);阴性对照MD NA M a r k e rD L ;g D(a a);N e g a t i v ec o n t r o l;图P C R扩增EHV g D(a a)F i g Am p l i f i c a t i o nr e s u l t so fEHV g D(a a)b yP C RMD NA标准D L ;p E T a()双酶切;重组质粒p E T a g D双酶切;重组质粒p E T a g DMD NA M a r k e rD L ;D o u b l ee n z y m ed i g e s t i o np r o d u c t so fp E T a()v e c t o r;D o u b l ee n z y m ed i g e s t i o np r o d u c t so f r e c o m b i n a n tp l a s m i d sp E T a g D;R e c o m b i n a n tp l a s m i d sp E T a g D图重组质粒p E T a g D酶切鉴定结果F i g E n z y m ed i g e s t i o n i d e n t i f i c a t i o no fp E T a g D多克隆抗体效价测定将纯化的g D蛋白以 n g/孔包被E L I S A板,兔抗g D蛋白的多克隆抗体按照不同的比例稀释分别孵育,显色结果见图,与阴性血清相比,免疫后的兔 血 清 与g D蛋 白 结 合 的 最 大 稀 释 度 为 .W e s t e r nb l o t验证多克隆抗体的有效性为了进一步验证多克隆抗体的有效性,分别收取EHV S D L C 毒株感染的R K 细胞和正常对照细胞,进行W e s t e r nb l o t检测,结果表明,制备的多克隆抗体可以识别EHV 的g D蛋白,蛋白条带约为 k u,与预期大小相符合(图).多克隆抗体的特异性检测以EHV 感染的R K 细胞为抗原,利用间接免疫荧光方法对g D蛋白多克隆抗体进行特异性检测.结果表明,EHV 感染的R K 细胞的胞浆内出现了特异性的红色荧光信号,而阴性对照细胞内未见荧光信号(图 A).说明多克隆抗体可识别g D蛋白的空间构像表位.以纯化的重组g D蛋白作为抗原,用W e s t e r nb l o t方法对g D蛋白多克隆抗体进行特异性检测,蛋白免疫印迹结果显示重组g D蛋白可被兔源抗g D蛋白的多克隆抗体特异性结合(图 B).M蛋白分子质量标准;诱导后的上清;诱导后的沉淀;mm o l/L咪唑洗脱液MP r o t e i nM a k e r;I n d u c e dp r o t e i ns u p e r n a t a n t;I n d u c e dp r o t e i np r e c i p i t a t e;g Dp r o t e i ne l u t e dw i t h mm o l/Li m i d a z o l e图重组g D蛋白诱导与纯化的S D S P AG E分析F i g S D S P AG Ea n a l y s i so f t h e i n d u c e da n dp u r i f i e dr e c o m b i n a n tg Dp r o t e i n图E L I S A方法检测兔抗g D蛋白多克隆抗体的效价F i g D e t e r m i n a t i o no f t i t e r so f r a b b i tg Dp o l y c l o n a la n t i b o d i e sb yE L I S A讨论马疱疹病毒(EHV ,EHV 和EHV )、马动脉炎病毒(E AV)感染与马属动物的呼吸系统疾病、流产密切相关,在澳大利亚、加拿大、土耳其、印度、德国、法国、中国等多个国家先后报道马疱疹病毒导致流产的病例,EHV 感染与孕驴流产和呼吸系统疾病密切相关 ,该病毒的感染及复制调控机制尚未见报道.动物医学进展 年第 卷第期(总第 期)R K 细胞感染EHV S D L C 毒株;对照R K 细胞R K c e l l s i n f e c t e dw i t hEHV S D L C s t r a i n;C o n t r o lR K c e l l s图W e s t e r nb l o t验证多克隆抗体F i g I d e n t i f i c a t i o no f t h ep o l y c l o n a l a n t i b o d i e sb yW e s t e r nb l o tg D蛋白决定马疱疹病毒的细胞嗜性,其在病毒的感 染 和 致 病 过 程 中 发 挥 重 要 作 用.g D作 为EHV 的重要抗原具有中和性表位,在马和小鼠感染模型中免疫后诱导病毒产生中和抗体,可以促进实验性感染呼吸道中EHV 的清除,这种免疫反应与灭活的EHV 疫苗诱导的免疫反应相似.当前EHV 在国内规模化驴场检出率较高,对驴产业危害巨大,国内外缺乏针对EHV g D的相关报道,尤其是g D抗体的缺乏严重制约EHV 感染的基础研究.从生物信息学角度分析g D蛋白的特性,结果发现g D蛋白是一个相对稳定的亲水性蛋白,理论A间接免疫荧光检测g D多克隆抗体的特异性;B免疫印迹检测g D多克隆抗体的特异性A T h es p e c i f i c i t yo fg Dp o l y c l o n a l a n t i b o d i e sa n a l y z e db yI F A;B T h es p e c i f i c i t yo fg Dp o l y c l o n a l a n t i b o d i e sa n a l y z e db yW e s t e r nb l o t图g D蛋白多克隆抗体的特异性检测F i g T h es p e c i f i c i t yd e t e c t i o no fg Dp o l y c l o n a l a n t i b o d i e s分子质量为 k u,存在两次跨膜区域,分别分布在 a a和 a a,因跨膜区具有强疏水性,去掉跨膜区有利于蛋白的表达.用原核表达载体p E T a()对EHV 的囊膜蛋白g D蛋白胞外区(a a)进行表达与纯化,发现重组g D蛋白以包涵体形式存在,经N I柱纯化后获得高纯度的g D蛋白,借助不同浓度的尿素逐步复性,以复性后的重组g D蛋白免疫新西兰兔,成功制备了针对g D蛋白的多 克 隆 抗 体,其 效 价 高 达 .经E L I S A、W e s t e r nb l o t及间接免疫荧光试验证实该多克 隆 抗 体 具 有 良 好 的 特 异 性,本 研 究 为 后 续EHV 免疫学检测方法的建立、致病机制及天然免疫反应机制的研究提供了材料.参考文献:L I UC,GOU W,L UG,e t a l C o m p l e t eg e n o m i c s e q u e n c eo f a ne q u i n eh e r p e s v i r u s t y p ew hs t r a i ni s o l a t e df r o m C h i n aJJV i r o l,():B R OWN LJ,B R OWN G,KY D DJ,e ta l F a i l u r et od e t e c te q u i dh e r p e s v i r u s t y p ea n dD NAi np l a c e n t a ea n dh e a l t h yn e w b o r nT h o r o u g h b r e df o a l sJJSA f rV e tA s s o c,():GA R V E Y M,S UA R E ZN M,K E R RK,e ta l E q u i dh e r p e s v i r u s:C o m p l e t eg e n o m es e q u e n c ea n da s s o c i a t i o nw i t ha b o r t i o ni nm a r e sJP L o SO n e,():e B R OWN I N G GF,F I C O R I L L IN,S TUD D E R T MJ A s i n i n eh e r p e s v i r u sg e n o m e s:c o m p a r i s o nw i t h t h o s eo f t h e e q u i n eh e r p e s v i r u s e sJ A r c hV i r o l,():S C HVA R T ZG,E D E R YN,MO S SL,e t a l E q u i dh e r p e s v i r u s i s o l a t e df r o ma na d u l td o n k e yi nI s r a e lJJE q u i n eV e tS c i,:王彤彤,刘梦媛,张敬文,等驴源马疱疹病毒型的分离鉴定与生物信息学分析J中国畜牧兽医,():WAN GTT,HULY,WAN G Y H,e ta l I d e n t i f i c a t i o no fe q u i n eh e r p e s v i r u s i nd o n k e ya b o r t i o n:ac a s er e p o r tJ V i r o lJ,:WAN GTT,HULY,L I U M Y,e t a l T h ee m e r g e n c eo fv i r a le n c e p h a l i t i s i nd o n k e y sb ye q u i dh e r p e s v i r u si nC h i n aJF r o n tM i c r o b i o l,:王彤彤,黄泽统,陈丽,等山东、河南、河北驴群马动脉炎病毒和马疱疹病毒型的检测与分析J动物医学进展,():邢效瑞,周正丽,信彩岩,等单纯疱疹病毒型糖蛋白g D的表达纯化及多克隆抗体的制备J中国病原生物学杂志,()徐萌等:马疱疹病毒型g D蛋白的生物信息学分析及多克隆抗体制备 王丹凤,马小力 H S V 糖蛋白B和糖蛋白D的T细胞表位重组核酸疫苗的构建及其免疫原性J中国医科大学学报,():C HOU L J E NKOD V,K I MIJ,C HOU L J E NKO V N,e ta l F u n c t i o n a l h i e r a r c h yo fh e r p e s s i m p l e xv i r u s v i r a l g l y c o p r o t e i n s i nc y t o p l a s m i cv i r i o ne n v e l o p m e n ta n de g r e s sJJV i r o l,():奉代燊,贾仁勇疱疹病毒糖蛋白介导的与宿主细胞膜融合的分子机制J病毒学报,():L I USA,S T A N F I E L D,C HO U L I E N K OVN,e t a l I n t r a m u s c u l a r i mm u n i z a t i o no fm i c ew i t ht h e l i v e a t t e n u a t e dh e r p e ss i m p l e xv i r u s v a c c i n e s t r a i nV C e x p r e s s i n g e q u i n e h e r p e s v i r u s(E HV)g l y c o p r o t e i nDg e n e r a t e sa n t i E HV i mm u n er e s p o n s e si nm i c eJJV i r o l,():e Z HAOY,C HAN GJ,Z HAN GB,e t a l T L R a g o n i s tS a l m o n e l l aa b o r t u s e q u if l a g e l l i nF l i Ce n h a n c e sF l i C g D b a s e dD NAv a c c i n a t i o na g a i n s te q u i n eh e r p e s v i r u si n f e c t i o nJ A r c hV i r o l,():O L A D UNN IFS,HO R OHOV D W,C HAMB E R S T MEHV :Ac o n s t a n t t h r e a t t o t h eh o r s e i n d u s t r yJF r o n tM i c r o b i o l,:G E R S TS,B O R C HE R SK,GOWE RS M,e ta l D e t e c t i o no fEHV a n dEHV i np l a c e n t a ls e c t i o n so fn a t u r a l l yo c c u r r i n gEHV a n dEHV r e l a t e da b o r t i o n s i nt h eUK:u s eo ft h ep l a c e n t a i nd i a g n o s i sJ E q u i n eV e tJ,():L A Z I CS,L U P U L OV I CD,GAUD A I R ED,e ta l S e r o l o g i c a le v i d e n c eo f e q u i n ea r t e r i t i sv i r u s i n f e c t i o na n dp h y l o g e n e t i c a n a l y s i so fv i r a l i s o l a t e s i ns e m e no fs t a l l i o n sf r o mS e r b i aJBMCV e tR e s,():C OO P E RCJ,A R R OYOLG,P E A R LDL,e ta l S u r v e yo ft h ee q u i n eb r o o d m a r ei n d u s t r y,a b o r t i o n,a n de q u i n eh e r p e s v i r u s v a c c i n a t i o n i nO n t a r i oJBMCV e tR e s,():TUR AN N,Y I L D I R I M F,A L T AN E,e ta l M o l e c u l a ra n dp a t h o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n so fEHV a n dEHV i n f e c t i o n s i nh o r s e s i nT u r k e yJ R e sV e tS c i,():ANA GHAG,GU L A T IBR,R I Y E S H T,e ta l G e n e t i cc h a r a c t e r i z a t i o no fe q u i n eh e r p e s v i r u si s o l a t e sf r o m a b o r t i o no u t b r e a k s i nI n d i aJ A r c hV i r o l,():T ON GP,D UAN R,P A L I D AN N,e ta l O u t b r e a ko fn e u r o p a t h o g e n i ce q u i dh e r p e s v i r u sc a u s i n ga b o r t i o n s i nY i l ih o r s e so fZ h a o s u,N o r t h X i n j i a n g,C h i n aJ BMC V e tR e s,():D AM I AN IA M,D EV R I E SM,R E I ME R SG,e ta l As e v e r ee q u i n eh e r p e s v i r u s t y p e(EHV )a b o r t i o no u t b r e a kc a u s e db yan e u r o p a t h o g e n i cs t r a i na tab r e e d i n gf a r mi nn o r t h e r nG e r m a n yJ V e tM i c r o b i o l,():S UT T ONG,GA R V E Y M,C U L L I NAN EA,e ta l M o l e c u l a rs u r v e i l l a n c eo fEHV s t r a i n s c i r c u l a t i n g i n f r a n c ed u r i n ga n da f t e r t h em a j o r o u t b r e a k i nn o r m a n d y i n v o l v i n gr e s p i r a t o r y i n f e c t i o n,n e u r o l o g i c a l d i s o r d e r,a n da b o r t i o nJ V i r u s e s,():B i o i n f o r m a t i cA n a l y s i sa n dP o l y c l o n a lA n t i b o d yP r e p a r a t i o no fE q u i n eH e r p e s v i r u sT y p eg DP r o t e i nXU M e n g,X IC a n k u n,WANGT i a n j i a o,L IR u i b o,D I NGX i a n g d a n,S UNQ i,HUL e y u,R E N H u i y i n g,L IL i a n g l i a n g,WANGT o n g t o n g(C o l l e g eo fA g r o n o m ya n dA g r i c u l t u r a lE n g i n e e r i n g,L i a o c h e n gU n i v e r s i t y,L i a o c h e n g,S h a n d o n g,C h i n a;C o l l e g eo fV e t e r i n a r yM e d i c i n e,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,Q i n g d a o,S h a n d o n g,C h i n a)A b s t r a c t:T h ea i mo fp r e s e n t s t u d yw a s t oa n a l y z eb i o i n f o r m a t i o n,e x p r e s s i n ga n dp r e p a r a t i o no fp o l y c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s tEHV g Dp r o t e i n F i r s t l y,p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s,h y d r o p h i l i aa n dh y d r o p h o b i c i t y,a n dt r a n s m e m b r a n ed o m a i nw e r e a n a l y z e dw i t hb i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s s o f t w a r e T h e e x t r a c e l l u l a r r e g i o no fg Dw a sa m p l i f i e dw i t hS D L C s t r a i ng e n o m e,a n dc l o n e di n t op E T a()v e c t o r F u r t h e r,t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t oB L (D E)a n di n d u c e dw i t hI P T Gf o