高效液相色谱法培训(课堂PPT).ppt
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1、 高效液相色谱法1高效液相色谱法(HPLC)是60年代末以经典液相色谱法为基础,引入了气相色谱的理论与实验方法,流动相用高压泵输送,采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法。与气相色谱法相比具有:适用范围广,样品预处理简单,分离效率高,流动相选择范围广,检测方法多为非破坏性的,流出组分可回收等优点。第一节 概述2HPLC液-固吸附液-液分配正相色谱反相色谱一般反相色谱离子对色谱离子抑制色谱离子交换色谱一般离子交换色谱离子色谱氨基酸分析空间排斥色谱凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱假相色谱胶束色谱环糊精色谱亲合色谱,手性色谱,毛细管电泳键合相色谱3n正相色谱正相色谱(normal phase)
2、n流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:n氨基柱、氰基柱、硅胶柱。n常用流动相为极性小的有机溶剂。n反相色谱反相色谱(reversed phase)n流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法。常用的分析柱有:ODS(C18),C8,C2。n常用流动相为甲醇-水,乙腈-水。4n离子抑制色谱离子抑制色谱(ion suppression chromatography)调节流动相的pH值,抑制组分的解离,增加组分在固定相中的溶解度,改善峰形,以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。n离子对色谱离子对色谱(ion pair chromatography)将反离子加入
3、流动相中,与呈解离状态的被测物作用,生成脂溶性的中性离子对络合物,从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度,改善分离效果,达到分离目的。n常用反离子有:季铵盐 用于酸类 烷基磺酸盐用于碱类5离子色谱法离子色谱法(ion chromatography)离子色谱是由经典的离子交换色谱发展起来的一种液相色谱技术,利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离,用于亲水性阴阳离子的测定。根据是否采用抑制柱,可分为抑制型离子色谱和非抑制型离子色谱。6n空间排斥色谱(空间排斥色谱(steric exclusion)n也称凝胶色谱,依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离,类似于分子筛作用。在一
4、定分子线团尺寸内,分子越大,保留时间越短。n凝胶渗透以有机溶剂为流动相n凝胶过滤以水溶液为流动相n对于相同化学组成的高分子化合物,其分子尺寸大小与分子量成正比,因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。7胶束色谱胶束色谱(micellar chromatography)表面活性剂在水中超过某一浓度(临界浓度)时,多余的表面活性剂不再溶解,聚集而成胶束(胶粒)。以胶束分散体系为流动相的色谱法称为胶束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系,不是真溶液;流动相中不含有机溶剂。因胶束色谱法的流动相是多相分散体系,在整个色谱体系中又增加了一相,故也被称为假相色谱(pseudo phase chroma
5、tography)。8n手性色谱手性色谱(chiral chromatography)n用于分离手性药物对映体的一种有效技术,可分为直接法和间接法两类:n直接法n手性固定相法(chiral stationary phase;CSP)n手性流动相法(chiral mobile phase additive;CMPA)n间接法手性试剂衍生化法 chiral derivatization reagent,CDR)9第二节 高效液相色谱仪色谱柱进样阀流动相检测器高压泵脱气装置 10高效液相色谱仪组成输液系统进样系统分离系统检测系统数据记录处理系统 11溶剂溶剂溶剂溶剂 色谱泵自动进样器 HPLCHPL
6、C色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱检测器废液数据处理系统液相色谱流程图液相色谱流程图1213启动液相色谱仪器的流程 l开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源,待设备通过自检后,打开计算机启动 色谱管理软件l准备流动相 过滤,脱气l色谱泵排气 用新配制的流动相灌注泵14液相柱-保留值与pH的关系 pH变化值0.1RS变化值1.6色谱柱:Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流动相:27%甲醇:73%磷酸 pH:2.5&2.6温度:50流速:1.0mL/min.152.流动相类别 按流动相组成分:单组分和多组分 按极性分:极性、弱极性、非极性 按使
7、用方式分:等度洗脱和梯度洗脱 16对溶剂的要求水:去离子水 自动纯水仪纯净水 商品瓶装水 溶剂:色谱纯(甲醇,乙腈,乙醇,丙酮,异丙醇)试剂:分析纯17不管采用何种途径,配制流动相应用新鲜水,水质要求越高放置时间越短。理想的HPLC用水应为18.2的超纯水,并通过0.22um的滤膜,除去热源、有机物、无机离子及空气等。18l过滤:0.45um或更小孔径滤膜 目的:除去溶剂中的微小颗粒,避免堵塞色谱柱,尤其是使用无机盐配制的缓冲液。l脱气:除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响:1)泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积 2)柱中气泡使流动相绕流,峰变形 3)检测器中的气泡产生
8、基线波动 过滤与脱气过滤与脱气192021流动相的保存l有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存l缓冲盐流动相:当日现配现用:低温下密封保存,一般不超过3天 防止微生物生长l有机溶剂与水(缓冲盐)混配的流动相:低温密封保存 防止有机相的挥发l选用适宜的容器22流动相的保存l有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存l缓冲盐流动相:当日现配现用:低温下密封保存,一般不超过3天 防止微生物生长l有机溶剂与水(缓冲盐)混配的流动相:低温密封保存 防止有机相的挥发l选用适宜的容器231梯度洗脱的特点(1)改善分离,加快分析速度;(2)改善峰形,减少拖尾,有利于痕量组分的检测;(3)增加峰容量;(4)强烈滞留的组
9、分不容易残留在柱上,保持柱性能长期良好;(5)下次分析时,流动相需要一段平衡时间;不同溶剂的UV吸收程度稍有差异,可能会引起基线漂移242梯度洗脱的主要条件 A 流动相/弱溶剂组成;B 流动相/强溶剂组成;梯度时间;梯度曲线:线性、凸型或凹型等。强溶剂 A%time1252526梯度:低压混合低压梯度用单泵产生梯度,泵前(低压端)混合对脱气要求高不易调节梯度的滞后体积如设计不当,梯度的准确性受影响滞后体积(系统体积)设计合理27梯度滞后:系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度
10、注意注意滞后体积包括进样器、阻尼滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度 阻尼器 混合器28梯度滞后大小的影响l滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如:滞后体积为2.0ml,流速1.0ml/min实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应,没有问题对微柱色谱影响更大,同上例但流速0.1ml/min实际梯度会比设置值晚20 分钟响应,不能接受l滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现滞后体积的变化会导致梯度重现性不好l普通分析型液相色谱的滞后体积为24ml29滞后体积变化的影响设计不好的HPL
11、C系统,滞后体积随反压变化滞后体积随反压变化的后果:梯度的准确性不好,造成:方法的适应性不好用静态梯度混合器;固定滞后体积可明显改善梯度特性梯度百分比保留时间梯度曲线好的梯度滞后曲线保留时间梯度百分比不好的梯度滞后曲线固定滞后体积,改善了梯度性能普通的低压梯度系统30n输液泵输液泵n多用柱塞往复泵,柱塞向前运动,液体输出,流向色谱柱;向后运动,将贮液瓶中液体吸入缸体。如此往复运动,将流动相 源源不断地输送到色谱柱中。n柱塞往复泵属于恒流泵,流量不受柱阻影响,泵压最高为400kg/cm2。n这种泵具有清洗容易,更换流动相方便等优点,但脉动性较大是其缺点。目前多采用双泵补偿法来克服这一问题。313
12、2避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。例:硝酸、硫酸、盐酸、卤化物,四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混合物,含强络合剂的溶液等。过滤用滤膜过滤或垂熔漏斗过滤脱气采用超声或过滤的方法注意注意流动相流动相使用前使用前冲洗冲洗使用含酸、碱、缓冲液的流动相后,必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗!33343536进样阀进样阀371柱柱泵泵324定量圈定量圈进样孔进样孔6废液废液5废液废液Inject6柱柱泵泵3214定量圈定量圈进样孔进样孔废液废液5废液废液Load38注意:使用后应清洗!39进样注意点进样注意点进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置,以免虹吸作用,使样品向针筒方向回流,或从废液口流出。使
13、用前后,要用流动相(不含酸碱等缓冲液)或甲醇或水冲洗针孔,用针孔清洗器)。40进样方法进样方法整个定量圈体积进样为获得好的精密度,进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于层流影响,需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相(见下图)。Sample Mobile phase41n例20l定量圈,进样体积不能超过10 l。否则,部分样品将会从出口流失。这是因为由于层流的关系,样品流经管中心的速度是平均速度的两倍。n进样前应用流动相冲洗进样孔,以除去前一针留下的样品。注射针必须清洗干净。部分定量圈体积进样当样品量少时,采用部分体积进样,进样量由微量注射器手动控制,要求:不得超过定量圈体积的1/2量42n
14、检测器检测器n紫外检测器n可变波长检测器n光电二极管阵列检测器n荧光检测器n电化学检测器n蒸发光散射n示差检测器n质谱43色谱图minH光谱图nmAA-曲线(定性)A-t 曲线 (定量)44蒸发光散射检测器是通用检测器,适用于无紫外吸收的化合物。原理:组分先引入已通气体(N2,空气)的蒸发室,加热,使流动相蒸发而被除去,样品组分形成气溶胶而产生光散射,测定散射光强度而获得组分的浓度信号。本法中流动相在检测前已蒸发,故梯度洗脱基线稳定。45组分的气溶胶喷雾蒸发检测N2光源溶剂泵色谱柱流出物注注意意:流动相必须是挥发性的,不能含缓冲盐,若调节pH可用氨水、醋酸。46质谱检测器47UV-VISDAD
15、 Flu Refra ElecConducotherMs 检测器使用统计48HPLC检测器应提供的功能对样品有响应并有一个输出信号应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系;并且所设计的校正技术应该促进这种关系49理想的HPLC检测器高灵敏度;可忽略的基线噪音宽的线性范围独立于流动相及操作参数的响应对压力、温度及流速等变化不敏感长时间操作的稳定性低死体积非破坏性选择性50灵敏度:信噪比灵敏度是信号与噪音的比值;即峰高与基线噪音的比值(S/N)检测限(LOD):S/N=24定量限(LOQ):S/N=810好的信噪比有利于:更好的色谱峰确认更好的定量更好地完成色谱峰纯度/均一性6:1NS51吸
16、光度(Absorbance UV/Vis)检测目前实验室中最流行的选择多数公司约75%的检测器是吸光度检测器(其中50%是多波长,25%是PDA)测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失吸光度与样品浓度呈线性关系在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大52吸光度检测器(UV/Vis)优点这种检测器简单、可靠多数人熟悉并喜欢这种技术可以作梯度实验并且是非破坏性的大多数有机化合物有一定程度的吸光度一般来说灵敏度还可以AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.00Parabens at 254 nm5
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