荧光光谱仪原理及其使用方法(哪些峰不是样品峰).ppt

岛津荧光光谱仪岛津荧光光谱仪RF-5301PC岛津国际贸易（上海岛津国际贸易（上海）有限公司有限公司 处处于于基基态态的的分分子子吸吸收收能能量量（电电、热热、化化学学和和光光能能）被被激激发发至至激激发发态态，然然后后从从不不稳稳定定的的激激发发态态返返回回至至基基态态并并发发射射出出光光子子，此此种种现现象象称称为为发发光光。发发光光分分析析包包括括荧荧光光、磷磷光光、化化学学发发光、生物发光等。光、生物发光等。物质吸收光能后所产生的光辐射称之为物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光荧光和磷光。分子发光分子发光不同类型的发不同类型的发光光最普通的是荧光最普通的是荧光.如果当如果当 一个物质吸收一定波一个物质吸收一定波长的光然后给出较长波长的光称为荧光长的光然后给出较长波长的光称为荧光.一些一些油漆、纸张具有荧光特性油漆、纸张具有荧光特性.其次是磷光其次是磷光.当一种物质吸收光当一种物质吸收光，然后再发出然后再发出光称为磷光光称为磷光.如果磷光物质暴露在阳光下，然后如果磷光物质暴露在阳光下，然后再带到暗室内再带到暗室内,给出的光称为磷光给出的光称为磷光.化学发光：当化学发光：当 2 种化学物质混合后给出的光种化学物质混合后给出的光.萤火虫发光是一种生物发光萤火虫发光是一种生物发光.萤火虫会产生萤火虫会产生.荧荧光素酶，导致发光光素酶，导致发光.类似化学发光，两种生物化类似化学发光，两种生物化学物质混合产生光学物质混合产生光.分子吸收、荧光、磷光辐射跃分子吸收、荧光、磷光辐射跃迁迁无辐射跃迁无辐射跃迁去活化过程去活化过程 处处于于激激发发态态分分子子不不稳稳定定，通通过过辐辐射射或或非非辐辐射射跃跃迁迁等等去去活活化化过程返回至基态过程返回至基态 。这些过程包括：。这些过程包括：1 1）振动弛豫）振动弛豫 在在液液相相或或压压力力足足够够高高的的气气相相中中，处处于于激激发发态态的的分分子子因因碰碰撞撞将将能能量量以以热热的的形形式式传传递递给给周周围围的的分分子子，从从而而从从高高振振动动能能层层失失活活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。至低振动能层的过程，称为振动弛豫。2 2）内转换）内转换 对对于于具具有有相相同同多多重重度度的的分分子子，若若较较高高电电子子能能级级的的低低振振动动能能层层与与较较低低电电子子能能级级的的高高振振动动能能层层相相重重叠叠时时，则则电电子子可可在在重重叠叠的的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S S2 2-S-S1 1；T T2 2-T-T1 1。定性分析定性分析 任任何何荧荧光光都都具具有有两两种种特特征征光光谱谱：激激发发光光谱谱与与发发射射光光谱谱。它们是荧光定性分析的基础。它们是荧光定性分析的基础。1 1）激发光谱）激发光谱 改改变变激激发发波波长长，测测量量在在最最强强荧荧光光发发射射波波长长处处的的强强度度变变化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。化，以激发波长对荧光强度作图可得到激发光谱。激激发发光光谱谱形形状状与与吸吸收收光光谱谱形形状状完完全全相相似似，经经校校正正后后二二者者完完全全相相同同！这这是是因因为为分分子子吸吸收收光光能能的的过过程程就就是是分分子子的的激激发过程。发过程。激激发发光光谱谱可可用用于于鉴鉴别别荧荧光光物物质质；在在定定量量时时，用用于于选选择择最适宜的激发波长。最适宜的激发波长。2 2）发射光谱）发射光谱 发发射射光光谱谱即即荧荧光光光光谱谱。一一定定波波长长和和强强度度的的激激发发波波长长辐辐照照荧荧光光物物质质，产产生生不不同同波波长长的的强强度度的的荧荧光光，以以荧荧光光强强度度对对其其波波长长作作图图可可得得荧荧光光发发射光谱。射光谱。由由于于不不同同物物质质具具不不同同的的特特征征发发射射峰峰，因因而而使使用用荧荧光光发发射射光光谱谱可可用用于于鉴鉴别别荧荧光光物物质质。萘萘激激发发、荧荧光光、磷磷光光如如右图所示。右图所示。激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系i i）波长比较波长比较 与与激激发发（或或吸吸收收）波波长长相相比比，荧荧光光发发射射波波长长更更长长，即即产产生生所所谓谓StokesStokes位移。（振动弛豫失活所致）位移。（振动弛豫失活所致）iiii）形状比较形状比较 荧荧光光光光谱谱形形状状与与激激发发波波长长无无关关。尽尽管管分分子子受受激激到到可可到到达达不不同同能能级级的的激激发发态态，但但由由于于去去活活化化（内内转转换换和和振振动动弛弛豫豫）到到第第一一电电子子激激发发态态的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。的速率或几率很大，好像是分子受激只到达第一激发态一样。换换句句话话说说，不不管管激激发发波波长长如如何何，电电子子都都是是从从第第一一电电子子激激发发态态的的最最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。iiiiii）镜像对称镜像对称 通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。通常荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。蒽的荧光光谱和吸收光谱蒽的荧光光谱和吸收光谱解释：能层结构相似性解释：能层结构相似性 荧荧光光为为第第一一电电子子激激发发单单重重态态的的最最低低振振动动能能层层跃跃迁迁到到基基态态的的各各个个振振动动能能层层而而形形成成，即即其其形形状状与与基基态态振振动动能能级级分布有关。分布有关。吸吸收收光光谱谱是是由由基基态态最最低低振振动动能能层层跃跃迁迁到到第第一一电电子子激激发发单单重重态态的的各各个个振振动动能能层层而而形形成成，即即其其形形状状与与第第一一电电子子激发单重态的振动能级分布有关。激发单重态的振动能级分布有关。由由于于激激发发态态和和基基态态的的振振动动能能层层分分布具有相似性，因而呈镜像对称。布具有相似性，因而呈镜像对称。S1S0荧光荧光吸收吸收产生荧光的条件产生荧光的条件i i）分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；分子具有与辐射频率相应的荧光结构（内因）；iiii）吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光。吸收特征频率的光后，应可产生具一定量子效率的荧光。即量子效率即量子效率 足够大：足够大：发射的光量子数发射的光量子数 =吸收的光量子数吸收的光量子数 1 1）跃迁类型：具有）跃迁类型：具有 *及及nn*跃迁结构的分子才会产生荧光。跃迁结构的分子才会产生荧光。且具且具 *跃迁的量子效率比跃迁的量子效率比nn*跃迁的要大得多。跃迁的要大得多。芳香属分子芳香属分子2 2）共轭效应：共轭度越大，荧光越强。）共轭效应：共轭度越大，荧光越强。平面环系统，绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环平面环系统，绝大多数荧光物质含有芳香环或杂环影响荧光及强度的因素影响荧光及强度的因素3 3）刚性结构：分子刚性）刚性结构：分子刚性（RigidityRigidity）越强，分子振动少，与越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。如荧光素如荧光素（大）大）与酚酞与酚酞（=0=0）；芴；芴（=1=1）与联苯与联苯（=0.18=0.18）。）。4 4）取代基：）取代基：给电子取代基增强荧光（给电子取代基增强荧光（p-p-共轭），如共轭），如-OHOH、-OR-OR、-NH-NH2 2、-CN-CN、NRNR2 2等；等；吸电子基降低荧光，如吸电子基降低荧光，如 -COOHCOOH、-C=O-C=O、-NONO2 2、-NO-NO、-X-X等；如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减等；如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失弱到消失5）溶剂效应：）溶剂效应：溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变 *及及 n*跃迁的能量）；跃迁的能量）；与溶剂作用从而改变荧光物质结构与溶剂作用从而改变荧光物质结构 来增加或降低荧光强度。来增加或降低荧光强度。6）温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度）温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度 或或“刚性刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。7）pH值：具酸或碱性基团的有机物质，在不同值：具酸或碱性基团的有机物质，在不同pH值时，其结构值时，其结构 可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因因pH值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。8）荧光猝灭：）荧光猝灭：碰撞猝灭；碰撞猝灭；静态猝灭；静态猝灭；转入三重态的猝灭转入三重态的猝灭；电子转移猝灭；电子转移猝灭；自猝灭。自猝灭。测量过程测量过程 提供能量提供能量(光源光源)选择激发波长选择激发波长(吸收吸收)照射样品照射样品样品吸收与发射荧光样品吸收与发射荧光(发射发射)选择发射波长选择发射波长测量测量激发光谱告诉我们什么？激发光谱告诉我们什么？化合物吸收波长化合物吸收波长 吸收强度吸收强度 溶剂吸收波长溶剂吸收波长激发光谱激发光谱 发射光谱告诉我们什么？发射光谱告诉我们什么？化合物荧光波长化合物荧光波长荧光强度荧光强度拉曼和瑞利散射拉曼和瑞利散射发射光谱发射光谱 哪些峰不是样品峰哪些峰不是样品峰瑞利散射瑞利散射激发波长峰激发波长峰发射和激发相同波长的峰发射和激发相同波长的峰拉曼散射拉曼散射溶剂发射波长溶剂发射波长(documented)与激发波长相差固定频率的波长与激发波长相差固定频率的波长2次或次或3次光次光发生在激发波长的发生在激发波长的2倍或倍或3倍波长处倍波长处 瑞利散射瑞利散射 颗粒的大小小于入射光的波长颗粒的大小小于入射光的波长.光通过样品后频率不变光通过样品后频率不变.由于弹性碰撞不存在由于弹性碰撞不存在能量能量的转移的转移.光线只是简单地改变方向，光线只是简单地改变方向，波长不变波长不变.粉末、悬浮液等样品粉末、悬浮液等样品.拉曼散射拉曼散射 样品吸收和发射光并伴随有样品吸收和发射光并伴随有能量转移能量转移的产生的产生.光通过样品后光的波长、频率发生了改变光通过样品后光的波长、频率发生了改变.与入射光相比发射光的频率可能更高或者更低与入射光相比发射光的频率可能更高或者更低.瑞利、拉曼散射和瑞利、拉曼散射和2次光次光 瑞利散射峰瑞利散射峰350拉曼峰拉曼峰397 2次光次光699792 外来峰的校正外来峰的校正截止滤光片去除截止滤光片去除2次、次、3次等高次光次等高次光差谱法去除拉曼和瑞利散射峰差谱法去除拉曼和瑞利散射峰用高纯溶剂用高纯溶剂(无荧光无荧光)扫描溶剂确定拉曼峰扫描溶剂确定拉曼峰维持测定温度与条件维持测定温度与条件高通和带通滤光片套件高通和带通滤光片套件高通滤光片用于去除散射光高通滤光片用于去除散射光定定 量量荧光强度与浓度的关系荧光强度与浓度的关系 If =2.3 f I0 bc=KCIf =荧光相对强度荧光相对强度 f =量子效率量子效率I0=入射光强度入射光强度 =吸收系数吸收系数b=光程长光程长c=浓度浓度该式只有该式只有 bc 0.050.05时才成立，即荧光测定只有在极时才成立，即荧光测定只有在极稀溶液中才可测定，否则校正曲线向浓度轴弯曲。稀溶液中才可测定，否则校正曲线向浓度轴弯曲。标准表与标准曲线标准表与标准曲线 荧光分光光度计荧光分光光度计原理和结构原理和结构荧光分光光度计示意图荧光分光光度计示意图发射单色器发射单色器PMPM分束器分束器光源光源激发单色器激发单色器 光闸光闸样品池样品池光源：氙灯、高压汞灯、激光；光源：氙灯、高压汞灯、激光；样品池：石英（低荧光材料）；样品池：石英（低荧光材料）；两个单色器：选择激发光单色器；两个单色器：选择激发光单色器；分离荧光单色器分离荧光单色器；两个检测器：光电倍增管。两个检测器：光电倍增管。主要部件主要部件RF-5301PC光路图光路图仪器性能仪器性能高水平高水平灵敏度：蒸馏水的拉曼峰灵敏度：蒸馏水的拉曼峰S/N比为比为150以上以上 （EX350nm，狭逢狭逢5nm）狭逢狭逢10nm拉曼峰拉曼峰S/N600利用先进的直流式长驱动机构，可及为迅速的得到理想的光利用先进的直流式长驱动机构，可及为迅速的得到理想的光谱谱可进行高速光谱监控，最高扫描速度可进行高速光谱监控，最高扫描速度波长范围：波长范围：220-900nm及及0次次狭逢：狭逢：1.5、3、5、10、15、20nm6档及激发档及激发6nm半高半高波长精度：波长精度：1.5nm波长扫描速度波长扫描速度Survey,Super,VeryFast,Medium,Slow,Very Slow的7段转换；Survey,约5,500nm/min.Super约3,000nm/min.仪器性能仪器性能功能强大、操作简便的软件系统功能强大、操作简便的软件系统功能：功能：激发光谱、荧光、同时光谱测定激发光谱、荧光、同时光谱测定定量分析（次标准曲线）定量分析（次标准曲线）时间扫描时间扫描动力学动力学只需打开自动检索最佳激发光和荧光波长只需打开自动检索最佳激发光和荧光波长从瑞利散射、拉曼散射及次光中自动判断出荧光从瑞利散射、拉曼散射及次光中自动判断出荧光使复杂的波长设置简单化使复杂的波长设置简单化检索最佳的激发光和荧光波长检索最佳的激发光和荧光波长四则运算四则运算数据变换（数据变换（1-4介导数，倒数，对数）介导数，倒数，对数）曲线平滑曲线平滑峰值检测峰值检测面积计算面积计算活度值计算等活度值计算等计算平均值计算平均值多样的数据处理多样的数据处理扩展功能和附件扩展功能和附件大样品室可安装大样品室可安装各种样品池架各种样品池架流动样品池流动样品池偏光装置等偏光装置等Ref-41丰富的任选附件：丰富的任选附件：单一恒温样品池（带搅拌器）该部件在恒温状态下搅拌试样，进行测定，最适合浮游细胞的荧光测定。利用恒温水的循环，可使样品池恒温化。搅拌器的速度可调节恒温水循环装置使用温度范围：室温85 0C温度调节精确度：+0.05 0C泵的流量：最大15L/18L/min(50/60Hz)容器的容量：约6.8LRef-42恒温四连池架利用恒温水的循环，一次可使4个样品池恒温化。适用的温度范围：5 0C-80 0C微量样品池装置取400ul的少量试样就能测定。试样可以放入与四面研磨样品池大小（10mm)的槽中，安装在样品池架上进行测定。测定偏光的辅助装置（用于紫外可见光或只用于可见光）利用荧光偏光度的测定获得关于分子的大小、流动性及分子周围环境的信息。高灵敏度池架固体（粉末）样品架固体、粉末样品，甚至样品池中的溶液也能用反射方式进行荧光测定。高台样品架LC流动样品池（12ul)用于高速液相色谱分析的高灵敏度分光荧光监控。自由选择激发光波长和荧光波长，可进行有选择的检测。LC流动样品池（120ul)用于分析邻苯二酚胺。使用内容积120ul的散射光少的双面反射型石英微型的流动样品池。光电倍增管换用光电倍增管，可进行900nm以内的荧光光谱的测定。直径8mm的试管架可以安装试管荧光应用领域荧光应用领域生命科学生命科学氨基酸、缩氨酸、蛋白质、脂质、糖类、维生素、辅酶、胺类等（1）定性、定量（2）研究酶反应：分析研究基质、辅酶、蛋白质（色氨酸、3-对羟基苯基丙氨酸）的反应机理（3）抗原、抗体反应（4）研究蛋白质-蛋白质，核酸-蛋白质，糖-蛋白质的相互作用（5）利用荧光检验（Fura-2等），分析细胞内离子（Ca2+等）（6）分析神经传递物质（苯邻二酚胺等）（7）研究核酸（8）研究生物膜荧光应用领域荧光应用领域食品科食品科学学氨基酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素、辅酶、抗生物质，食品添加物（调味料、防酸化剂等），食物油（植物油、动物油），农药（氨基甲酸酯类、有机磷类、1-萘基醋酸）（1）食品的成分分析、定量分析（2）残留农药的检测荧光应用领域荧光应用领域化学、环境化学、环境科学科学各种有机化合物、无机化合物、高分子化合物（纤维、塑料、橡胶等）（1）微量分析（2）物性研究（3）光化学反应研究（4）高分子聚合研究（5）光敏材料的研究（6）大气、水质、土壤的污染评估多环芳香烃类（7）原油、煤的分析样品形态样品形态液体液体Cell suspensionsTransparent solutions固体固体PowdersCells mounted on slides荧光分析的特点荧光分析的特点 灵敏度高：视不同物质，检测下限在灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.1-0.0010.1-0.001 g/mLg/mL之间。之间。比比UV-VisUV-Vis的灵敏度高得多！的灵敏度高得多！选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光 量子效率、荧光寿命等。量子效率、荧光寿命等。应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强 荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测 量的量的因素较多。因素较多。