实验十二杀菌剂的生物测定孢子萌发法市公开课金奖市赛课一等奖课件.pptx

试验十二杀菌剂生物测定试验十二杀菌剂生物测定孢子萌发法孢子萌发法 第1页第1页一、试验目 l学习并掌握杀菌剂生物测定办法之一学习并掌握杀菌剂生物测定办法之一-孢子萌发法。孢子萌发法。将孢子哺育在含有一定药剂介质中，在保温、保湿条将孢子哺育在含有一定药剂介质中，在保温、保湿条件下培养一定期间后镜检，依据杀菌剂对病原真菌孢子萌件下培养一定期间后镜检，依据杀菌剂对病原真菌孢子萌发克制作用来测定药剂生物活性。发克制作用来测定药剂生物活性。二、试验原理二、试验原理 载玻片载玻片含药介质含药介质孢子孢子孢子孢子含药介质含药介质第2页第2页l 其它药剂选取适当溶剂（如丙酮、二甲基亚砜、乙其它药剂选取适当溶剂（如丙酮、二甲基亚砜、乙醇等）溶解，用醇等）溶解，用0.1%0.1%吐温吐温8080无菌水溶液稀释。依据预无菌水溶液稀释。依据预备试验，设置备试验，设置5-75-7个系列质量浓度，有机溶剂最后含量个系列质量浓度，有机溶剂最后含量不超出不超出2%2%。三、试验环节三、试验环节（1 1）药剂配制）药剂配制l 水溶性药剂直接用无菌水溶解稀释水溶性药剂直接用无菌水溶解稀释第3页第3页（每毫升（每毫升1101105 5-110-1107 7个孢子，并加入个孢子，并加入0.5%0.5%葡萄糖溶液）葡萄糖溶液）（2）孢子悬浮液配制）孢子悬浮液配制培养基上病原真菌孢子培养基上病原真菌孢子洗脱洗脱过滤过滤离心离心（1000r/min）5min倒去上清液，加入去离子水倒去上清液，加入去离子水离心离心去离子水将孢子重悬浮去离子水将孢子重悬浮第4页第4页然后架放于带有浅层水培养皿中，加盖保湿培养于适宜温度培养箱中。然后架放于带有浅层水培养皿中，加盖保湿培养于适宜温度培养箱中。（3）药剂处理）药剂处理低浓度低浓度高浓度高浓度孢子悬浮液孢子悬浮液0.5mL药液药液0.5mL混合均匀混合均匀微量加样器微量加样器凹玻片凹玻片第5页第5页四、结果调查与统计分析四、结果调查与统计分析 当空白对照孢子萌发率达到当空白对照孢子萌发率达到90%90%以上时，检查各处理孢子萌发情况。以上时，检查各处理孢子萌发情况。每处理各重复随机观测每处理各重复随机观测3 3个以上视野，调查孢子总数不少于个以上视野，调查孢子总数不少于200200个，分别个，分别统计萌发数和孢子总数。孢子芽管长度不小于孢子短半径视为萌发。同统计萌发数和孢子总数。孢子芽管长度不小于孢子短半径视为萌发。同时还应观测统计芽管生长异常情况、附着胞形成数等。时还应观测统计芽管生长异常情况、附着胞形成数等。第6页第6页试验结果统计试验结果统计处理处理处理处理浓度浓度浓度浓度ppmppmppmppm浓度对数浓度对数浓度对数浓度对数检查检查孢子孢子总数总数孢子萌发数孢子萌发数孢子萌发数孢子萌发数孢子萌发孢子萌发孢子萌发孢子萌发%更正萌发更正萌发更正萌发更正萌发%机率机率机率机率硫酸铜硫酸铜硫酸铜硫酸铜多菌灵多菌灵多菌灵多菌灵CKCKCKCK第7页第7页 计算各处理孢子萌发相对克制率，采用浓度对数-几率值法计算各药剂EC50、EC90,原则误及其95%置信限，评价供试药剂对靶标菌孢子萌发克制活性。但在观测试验结果时，除要观测孢子萌发与不萌发这两种截然不同形态外，更要注意萌发芽管形态改变，即芽管是否有膨大现象，是否有附着器形成，附着器颜色深浅，发芽管长度、以及侵入菌体形成情况等，即从微细观测中来了解药品作用方式。孢子萌发法突出长处是快速，试验当天即可取得结果，尤其适合于保护剂筛选。第8页第8页