复制分子生物学.pptx

当染色质重建时，已经与核小体结合的DNA 展开使两子链复制。那么，此位点上原来存在的核小体如何变化呢？组蛋白八聚体是解离成自由组蛋白重复使用，还是保持组装状态呢？原组蛋白八聚体没有被保留。解聚与重组的方式远不清楚。核小体在核小体在DNA 上的位置有特异性吗？上的位置有特异性吗？现在已经清楚，组蛋白八聚体在DNA 上组装并不是与序列无关的随机结合，有些情况下模式通过内部途径实现，定位取决于DNA 的结构特征；有些情况下模式通过外部途径达成，定位取决于其它蛋白质与DNA 或/和组蛋白的相互作用。历史上曾经提出过历史上曾经提出过DNA复制的复制的3种假设种假设2.3.1 DNA的半保留复制In 1958,Meselson and Stahl provided the experimental proof for the semiconservative model of DNA replication（著名实验：用同位素标记，密度（著名实验：用同位素标记，密度梯度离心。）梯度离心。）大肠杆菌在含有大肠杆菌在含有15NH4Cl为唯一氮源的培养基上生长多为唯一氮源的培养基上生长多代代，这时，这时DNA中的嘌呤和嘧啶中的氮几乎全是中的嘌呤和嘧啶中的氮几乎全是15N。然。然后后将大肠杆菌转移到含有将大肠杆菌转移到含有14NH4Cl的培养基中的培养基中，在不同在不同的间隔时间，收集细菌并裂解，提取的间隔时间，收集细菌并裂解，提取DNA，并用，并用CsCl梯度密度超速离心进行分析梯度密度超速离心进行分析（这种方法可以分辨在密度（这种方法可以分辨在密度上存在上存在0.01g/mL差异的生物大分子）。差异的生物大分子）。上述实验证明新合成的上述实验证明新合成的DNA同时含有同时含有15N和和14N，因此，因此DNA的复制不可能是全保的复制不可能是全保留复制。留复制。为了证明为了证明DNA复制不是分散复制，复制不是分散复制，Meselson and Stahl 进行了进一步的实验，进行了进一步的实验，他们将他们将15N标记的细菌在标记的细菌在14N培养基上保持培养基上保持一代，然后提取一代，然后提取DNA，加热到，加热到100度，使度，使DNA双链变性为单链，再对变性的单链进双链变性为单链，再对变性的单链进行行CsCl梯度密度超速离心，发现了两条分梯度密度超速离心，发现了两条分开的条带，表明一条链是开的条带，表明一条链是15N标记的，另一标记的，另一条链是条链是14N标记的，因此标记的，因此DNA复制是半保复制是半保留复制，而不是分散复制。留复制，而不是分散复制。在在DNADNA复制过程中复制区域双螺旋解旋并分开，以每条复制过程中复制区域双螺旋解旋并分开，以每条单链为模板，按碱基互补配对原则，由单链为模板，按碱基互补配对原则，由DNADNA聚合酶催化合成聚合酶催化合成新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形新的互补链，结果由一条链成为互补的两条链，这样新形成的两个成的两个DNADNA分子与原来的分子与原来的DNADNA分子的碱基序列完全相同。分子的碱基序列完全相同。由于每个子代由于每个子代DNADNA的一条链来自亲代的一条链来自亲代DNADNA，另一条链则，另一条链则是新合成的。这种复制方式称为半保留复制。是新合成的。这种复制方式称为半保留复制。DNA复制是半保留复制（semi conservative replication)过程复杂；需要多种酶和蛋白质参与（包括拓扑异构酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及连接酶等）。DNA的复制的复制-半半保留复制保留复制DNADNA半保留复制的生物学意义半保留复制的生物学意义:DNA replication by semi-conservation makes the two daughter duplexes have the same sequence as the parental duplex.Thus,genetic message of organism keeps relative stable.DNA is much more stable than other components in cell.This is consisted with its functioncarrier of genetic message.The origin of replication（复制起始点（复制起始点）：）：a sequence of DNA at which replication is initiated（即 DNA复制起始发生的位点）.复制从特定位点开始，双螺旋的两条链分开形成两条复制从特定位点开始，双螺旋的两条链分开形成两条DNADNA模板，模板，逐步向未复制部分扩大；逐步向未复制部分扩大；刚分开的两条模板链与未复制的刚分开的两条模板链与未复制的双链之间的连接区（即双链之间的连接区（即正在复制的分叉部位正在复制的分叉部位）称为）称为复制叉（复制叉（replication fork ）。）。The replicon（复制子）（复制子）is the DNA under the control of one origin of replication.Any piece of DNA which replicates as a single unit is called a replicon.（即具有一个复制起点,作为一个复制单位的DNA。）2.3.2 复制的起点、方向和速度DNA链的复制过程示意图DNA的单向复制只在噬的单向复制只在噬菌体和某些质粒中观察菌体和某些质粒中观察到了到了复制叉移动的方向和速度是多种多样复制叉移动的方向和速度是多种多样的，但以双向等速移动为主。的，但以双向等速移动为主。真核生物：双向等速真核生物：双向等速原核生物：双向等速（大肠杆菌）原核生物：双向等速（大肠杆菌）双向不等速（枯草杆菌）双向不等速（枯草杆菌）先单向后双向（先单向后双向（R6K质粒）质粒）单向（单向（ColE1质粒）质粒）Autoradiograph of replicating Bacillus subtilis DNADormant bacterial spores（休眠的细菌孢子）were germinated in in the presence of low-the presence of low-radioactivity of radioactivity of 3 3H-H-thymidinethymidine ,so the newly formed replicating bubbles immediately became slightly labeled.After the bubbles had grown some what,more more radioactivityradioactivity 3H-3H-thymidines was thymidines was added toadded to label the DNA for short period.J.Huberman and A.Tsais experiment:Fruit fly Drosophila melanogaster First with high levels of 3H-thymidinehigh levels of 3H-thymidine Second with light level label复制速率复制速率真核生物：复制叉移动速率1kb-3kb/min，有多个复制起始点，可进行多复制子的同步复制。原核生物：复制叉移动速率50kb/min，每个复制单位在30-60min内完成复制，只有一个复制起始点，起始点可以连续发动复制。DNA的复制是由固定的起始点开始的（固定的序列），并识别参与复制起始的特殊蛋白；复制叉以DNA分子上某一特定序列为起点，移动的方向和速度多种多样，但以双向等速方式为主。1 线性DNA双链的复制 所有已知的核酸聚合酶，无论是DNA聚合酶还是RNA聚合聚合酶都只从5向3端移动，新链的合成方向与聚合酶移动方向一致，即只能是53；而对于DNA的合成必需一段引物的存在，体内DNA复制时，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必须切除，切除后，5端如何起始呢？2.3.3 复制的几种主要方式延伸 端粒端粒是染色体末端的DNA重复序列，作用是保持染色体的完整性。DNA每次复制端粒就缩短一点。一旦端粒消耗殆尽，染色体则易于突变而导致动脉硬化和某些癌症。1.通过将线性复制子转变为环状或多聚分子。如噬菌体（成环）、T7噬菌体（多聚分子）。2.DNA可形成特殊的结构。如草履虫的线性线粒体DNA在末端形成发夹，使分子没有游离末端。3.某种蛋白质可能会介入，在真正的末端上启动。几种线性病毒核酸具有与5端碱基共价结合的蛋白质，其中了解最清楚的例子是腺病毒 DNA。4.末端是可变的，而不是精确确定的。真核生物染色体可能采用这种方式，在这种情况下，DNA末端的短重复序列的拷贝数改变（如端粒的复制）。?二聚体二聚体3-OHATCGTAGCATCGTAGC3-OH专一性核专一性核酸内切酶酸内切酶T7噬菌体的末端复制噬菌体的末端复制腺病毒通过蛋白引发的腺病毒通过蛋白引发的DNA复制复制2 环状DNA双链的复制型 （如大肠杆菌E.coli）滚环型（rolling circle）（如X174）D-环形（D-loop）（如哺乳动物线粒体DNA）2.4 原核生物和真核生物 DNA复制的特点过程复杂；需要多种酶和蛋白质参与（包括拓扑异构酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白、引物合成酶、DNA聚合酶及连接酶等）。2.4.1 原核生物DNA复制的特点1.1 1.1 解旋酶解旋酶（helicase)DNADNA复制时，解旋酶利用复制时，解旋酶利用ATP的能量启动的能量启动DNADNA解旋，使双链分开形成单链。解旋，使双链分开形成单链。1.DNA双螺旋的解旋双螺旋的解旋在在E.coliE.coli中，解旋酶中，解旋酶DnaBDnaB作为引发体的成员，参与复制作为引发体的成员，参与复制叉形成，并结合于一个复制叉，利用叉形成，并结合于一个复制叉，利用ATP水解的能水解的能量解开双螺旋，量解开双螺旋，推动复制叉向前延伸推动复制叉向前延伸;大部分大部分DNADNA解链酶可沿后随链的解链酶可沿后随链的5 5-3-3方向随着复制叉方向随着复制叉的前进而移动，的前进而移动，RepRep蛋白则沿前导链模板的蛋白则沿前导链模板的3 3-5-5方向移动。方向移动。生物体内的解旋酶有多种，有些解旋酶还参与生物体内的解旋酶有多种，有些解旋酶还参与DNA修复，修复，重组等非复制过程。重组等非复制过程。1.2 1.2 拓扑异构酶（拓扑异构酶（topoisomerase)topoisomerase)可以使可以使DNADNA的两种拓扑异构体互变的酶。的两种拓扑异构体互变的酶。DNADNA分子在细胞内以超螺旋形式存在，分子在细胞内以超螺旋形式存在，DNADNA拓拓扑异构酶催化同一扑异构酶催化同一DNADNA分子不同超螺旋状态之分子不同超螺旋状态之间转变。间转变。功能：功能：与与DNA形成共价结合中间体，使形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯键断裂，磷酸二酯键断裂，形成形成DNA nick，DNA的一条链进行解旋旋转而改变的一条链进行解旋旋转而改变DNA分子的分子的拓扑状态。拓扑状态。v 参与复制、转录、重组。参与复制、转录、重组。效应：效应：拓扑异构酶可使拓扑异构酶可使DNA发生：发生：连环化（连环化（catenate)脱连环化脱连环化(decatenate)打结（打结（knot)解结（解结（unknot)解旋酶沿着复制叉向前延伸产生了一段单链，解旋酶沿着复制叉向前延伸产生了一段单链，细胞内大量的单链结合蛋白能和单链细胞内大量的单链结合蛋白能和单链DNA结结合，防止其重新配对形成双链。合，防止其重新配对形成双链。1.3 1.3 单链结合蛋白单链结合蛋白（SSB）SSB SSB的作用：的作用：v 使使DNADNA单链保持一种伸展构象，它们与磷酸骨单链保持一种伸展构象，它们与磷酸骨架结合，离开暴露的碱基，此次那些碱基能作架结合，离开暴露的碱基，此次那些碱基能作为为DNADNA合成的模板；合成的模板；v 使解开的单链不形成发卡结构；使解开的单链不形成发卡结构；v 保护保护DNADNA单链不受单链不受DnaseDnase水解。水解。2 DNA复制的引发复制的引发oriC(84min)（dnaA结合位点）2.1 复制起始区复制起始区此序列在所有细菌复制起始位点中此序列在所有细菌复制起始位点中都是保守的。都是保守的。oriC在不同原核生物中有同源性，很多细菌的在不同原核生物中有同源性，很多细菌的oriC区区在结构上相似的，在序列上有相当的保守性，而在结构上相似的，在序列上有相当的保守性，而且在分类上越接近的细菌其同源性越高，表明且在分类上越接近的细菌其同源性越高，表明DNA复制起点的重要性。复制起点的重要性。五聚物 将将DNA分子的复制起始位点（复制器）连接到任何分子的复制起始位点（复制器）连接到任何一个一个DNA分子上，都能起始其复制。分子上，都能起始其复制。v起始蛋白与特异序列结合、促进解旋和起始蛋白与特异序列结合、促进解旋和引发体组装引发体组装2.2 引发体是由很多蛋白质因子参与形成的。引发体是由很多蛋白质因子参与形成的。引发体primosome引发前体preprimosome引发酶Primase(DnaG)DnaB helicaseDnaC helicase assistantDnaInnn只有当引发前体把这6种蛋白质合在一起并与引发酶进一步组装后形成引发体，才能发挥其功效。引发酶（引发酶（Primase，或引物酶，或引物酶)DNA DNA 合成时需要一段大约合成时需要一段大约6-106-10个核苷酸长的个核苷酸长的RNARNA，作为作为DNA DNA 合成的引物；这段引物是由引物酶合成的。合成的引物；这段引物是由引物酶合成的。是在特定环境下发挥作用的是在特定环境下发挥作用的RNARNA聚合酶，仅用于合成聚合酶，仅用于合成DNADNA复制所需的一小段复制所需的一小段RNARNA。引物酶以单链引物酶以单链DNADNA为模板，利用核糖核苷酸为模板，利用核糖核苷酸直接从头合成直接从头合成RNARNA引物引物（6-10nt)6-10nt)。引物酶催化引物引物酶催化引物RNARNA的合成，但它不同于的合成，但它不同于RNARNA聚合酶聚合酶。引物酶只在复制起点处合成引物酶只在复制起点处合成RNARNA引物以引发引物以引发DNADNA复制，复制，而而RNARNA聚合酶则是启动聚合酶则是启动DNADNA转录合成转录合成RNA RNA，从而将，从而将遗传信息由遗传信息由DNADNA传递到传递到RNARNA。E.coliE.coli的引物酶由一条肽链组成，分子量为的引物酶由一条肽链组成，分子量为60KD,DnaG60KD,DnaG基因编码。基因编码。减少致死突变。减少致死突变。DNADNA合成中最初几个核苷酸正确性远合成中最初几个核苷酸正确性远比其后的低。引物比其后的低。引物RNA RNA 随后被降解，从随后被降解，从而减少了复制错误。而减少了复制错误。引物的意义：DnaA protein molecules binds to the four 9 bp repeats in the origin，then recognizes and successively denatures the DNA in the region of the three 13 bp repeats,which are rich in A=T pairsThis process requires ATP and the bacterial histonelike protein HU.HU prevents nonspecific initiation at sites other than oriCThe DnaA protein then mediates the separation of the strands of the DNA duplex by acting on three AT-rich tandem repeats located at the 5-end of the sequence defining oriCFormation of this 45-bp“open complex”by DnaA protein is ATP-dependent.3.DNA复制的过程复制的过程DnaB protein(a hexamer of 50-kD subunits)binds to the“open”oriC.DnaB protein is delivered to oriC by DnaC protein assisted by DnaT protein.The addition of DnaB protein completes assembly of the pre-priming complex（引发前体）.ATP hydrolysis drives the formation of this complex.DnaB protein has helicase activity and it further unwinds the DNA in the pre-priming complex in both directionsSSB tetramers coat singlestranded regions as they arise.引物酶（DnaG）结合到引发前体上组装成了引发体（primosome）。在SSB和拓扑异构酶的参与下，引发体可在单链DNA上移动，在DnaB的帮助下，识别复制的起始起点位置。引发体在复制叉先合成先引发体在复制叉先合成先导链的导链的RNARNA引物，再合成后滞引物，再合成后滞链的引物（链的引物（Primase association with DnaB is transient;once a primer has been synthesized,primase dissociates until another round of primer synthesis is necessary.)在复制叉在复制叉DNA polymerase DNA polymerase III III 组装成组装成非对称的二聚体非对称的二聚体，它催化第一个按碱它催化第一个按碱基互补配对原则加在基互补配对原则加在引物的引物的端，而进端，而进入链的延伸阶段入链的延伸阶段.冈崎片段与半不连续复制冈崎片段与半不连续复制冈崎片段(Okazaki fragment)一般长约1000-2000个碱基，原核比真核长。前导链Leading strand后随链Lagging strand然后，RNaseH(?)降解RNA引物，DNA聚合酶I补齐缺口，再由DNA连接酶连接两个冈崎片段。4.复制的终止复制的终止在在E.coli DNA上存在着复制的终止位点上存在着复制的终止位点;终止位点的序列终止位点的序列Ter():A A T T A G T A T G T T G T A A C T A A A G TT T A A T C A T A C A A C A T T G A T T T C A终止序列可被终止序列可被tus蛋白（蛋白（tus基因编码）识别，并结基因编码）识别，并结合于其上；合于其上；Ter-Tus复合物能使DnaB不再将DNA解链，使复制叉停止前移；E.coli两个复制叉在相距两个复制叉在相距100kb时，复制速度减慢时，复制速度减慢从而协调两个复制叉到达时间。从而协调两个复制叉到达时间。Tus protein只让一侧复制叉通过，使只让一侧复制叉通过，使DNA的复制的复制在终点位置终止。在终点位置终止。复制终止的协调：复制终止的协调：在在Forks meet 两侧各有两侧各有几个段序列几个段序列如：如：terE.D.A.terC.B。当一侧复制。当一侧复制叉前进的快，而另一侧叉前进的快，而另一侧前进的慢时，快侧复制前进的慢时，快侧复制酶则会在酶则会在ter位点停止，位点停止，等待直到慢侧跟上。等待直到慢侧跟上。以上似乎构成一个以上似乎构成一个“replication fork trap”E.coli DNA复制到最复制到最后，子代后，子代DNA链套在一起链套在一起,由由DNA拓扑异构酶拓扑异构酶II切开切开双链将两个双链将两个DNA分子分开分子分开成为两个完整地与亲代成为两个完整地与亲代DNA分子完全一样的子代分子完全一样的子代DNA分子。分子。5.DNA聚合酶聚合酶细菌中，已有五种DNA聚合酶被发现。*DNA聚合酶聚合酶I（Pol I）：C端(Klenow 片段)具有聚合酶活性和3-5外切酶活性；N端具有5-3外切酶活性。这三种不同的活性存在于酶的三个分开的活性中心上。3-5外切酶活性与外切酶活性与DNA聚合酶的校正功能有关。聚合酶的校正功能有关。53的外切活性在DNA损伤的修复中可能起其重要作用。对冈崎片断5端RNA引物的去除，依赖此种外切酶活性。DNA聚合酶聚合酶I不是主要的复制酶不是主要的复制酶,而是而是在在DNA修复中起作用修复中起作用*DNA聚合酶II（Pol II）：活性低，在DNA损伤修复中起作用。*DNA聚合酶III（Pol III）：活性强，具有聚合酶活性和3-5外切酶活性，在大肠杆菌DNA复制过程中起主要作用。*DNA聚合酶IV（Pol IV）：SOS修复中发挥作用。*DNA聚合酶V（Pol V）：SOS修复中发挥作用。6 DNA连接酶（连接酶（ligase)催化双链DNA切口处的5-磷酸和3-羟基生成磷酸二酯键;连接反应需要供给能量。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶以NAD作为能量来源;动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。DNA DNA 滞后链上的复制是不连续的，各合成的片段需要连接酶滞后链上的复制是不连续的，各合成的片段需要连接酶连接，连接酶的反应条件：连接，连接酶的反应条件：v 被连接的两链必须与另一链（模板链）互补；被连接的两链必须与另一链（模板链）互补；v 两链相邻；两链相邻；v 每次只能连接一个缺口；每次只能连接一个缺口；v使一条链的使一条链的5-P 5-P 与另一链的与另一链的3-OH3-OH形成磷酸二酯键；形成磷酸二酯键；v 缺口缺失核苷酸不连接。缺口缺失核苷酸不连接。T4 Ligase T4 Ligase 特性：特性：v可连接可连接DNA与与DNA，也可连接，也可连接RNA与与RNA。v可连接可连接DNA中的单链切口，也可连接粘性末端切中的单链切口，也可连接粘性末端切口和齐末端切口。口和齐末端切口。v T4 Ligase 可作为重组工具酶。可作为重组工具酶。T4连接酶T4连接酶2.4.2 真核生物DNA复制的特点真核生物是多点复制，原核生物是单点复制。真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA复制不能再开始；原核生物起始点上可连续开始新的DNA复制。复制起始位点复制起始位点：自主复制序列(autonomous replicating sequence,ARS)这个序列是染色体正常起始复制所必需的。所有的ARS的DNA均有一段保守序列：-A(T)TTTAT(C)A(G)TTTA(T)-ARS能结合起始点识别复合物(origin recognition complex,ORC)。已发现已发现15种真核种真核DNA聚合酶，在哺乳动物细胞中有聚合酶，在哺乳动物细胞中有5种种：Pol：做为引发酶合成RNA引物，然后做为DNA合成酶延伸此段RNA引物；合成数百个碱基后，将后续的延伸过程交给Pol 与。Pol：在DNA修复中起作用。Pol：复制线粒体DNA。Pol：Pol 与Pol 是真核细胞的主要DNA聚合酶。Pol：填补引物空隙，切除修复，重组。（真核生物DNA聚合酶一般不具有外切酶活性。）去除去除RNA引物引物：分两步，RNA酶H1切断DNA-RNA，FEN1蛋白降解RNA片段。2.4.3 DNA复制的调控1.大肠杆菌染色体DNA的复制调控复制起始不依赖于细胞分裂，复制终止则能引发细胞分裂。复制调控主要发生在起始阶段。dnaA-ADP复合物；非甲基化GATC-SeqA复合物对dam-E.Coli 的研究表明，半甲基化的Ori C不能发动一轮新的复制在复制过程中，Ori C的半甲基化状态约保留13 min。而在基因组其它区域的GATC位点，在复制后1.5 min内即被甲基化。2.ColE1质粒DNA的复制调控Rop蛋白和反义RNA控制了起始DNA复制所必需的引物合成。RNA1通过氢键配对与引物RNA前体相互作用，阻止了RNaseH加工引物前体，使其不能转化为有活性的引物而对复制起负调控作用。Rop蛋白能提高RNA1与引物前体的相互作用，从而加强了RNA1的负调控作用。3.真核细胞DNA的复制调控（1）细胞生活周期水平调控DNA复制只发生在S期（2）染色体水平调控不同部位的复制子按一定的时间顺序在S期起始复制（3）复制子水平调控