微生物分子生态学.pptx

第八章第八章 微生物分子生态学微生物分子生态学李永峰李永峰 教授教授张洪张洪 研究生研究生目录目录微生物分子生态学的理论基础微生物分子生态学的理论基础1外界环境对微生物的影响外界环境对微生物的影响2微生物在环境生物修复中的分子生态学微生物在环境生物修复中的分子生态学3微生物生态学中分子生物学技术和方法微生物生态学中分子生物学技术和方法48.1 8.1 微生物分子生态学理论基础微生物分子生态学理论基础微生物分子生态学微生物分子生态学:是生态学的一个重要分支，它在普通生态学的基础上，通过对微生物的信息生态学、行为生态学、微生物生态学的研究，探讨微生物与环境之间的生态性微生物微生物生态学信息生态学行为生态学环境群落生态学种群生态学分子生态学生态系统生态学微生物系统污染生态学系统极端环境系统表面生态系统微生物通过改变遗传结构和生理状况来响应环境变化，形成响应调节系统。人们重视微生物驯化、诱变和基因工程等来提高生物修复工程效率。8.1微生物分子生态学理论基础微生物分子生态学理论基础微生物与细微生物与细胞的信息交胞的信息交流流病毒分子生病毒分子生态学态学微生物与外微生物与外界因子的生界因子的生态效益态效益基本理论基本理论阐述微生物与细胞之间通信的分子关系。解决细菌、病毒对人类感染的调控过程。微生物在环微生物在环境修复中的境修复中的分子生态学分子生态学使人们了解到动植物病毒的分子生态机制，探索一套人类对病毒的预防和治疗措施。8.2 外界环境对微生物的影响外界环境对微生物的影响微生物功能及生理活动微生物功能及生理活动影响影响光照光照温度水和水活度极端环境pH8.2.1 光照对微生物的分子生态性影响光照对微生物的分子生态性影响环式光合磷酸化环式光合磷酸化非环式光合磷酸化非环式光合磷酸化绿色细菌和绿硫细菌的电子传递绿色细菌和绿硫细菌的电子传递光照对微生物的光照对微生物的分子生态性影响分子生态性影响嗜盐菌紫膜的光合作用嗜盐菌紫膜的光合作用不需要氧，主要在不需要氧，主要在DNA分子的嘧啶上分子的嘧啶上光光合合作作用用紫紫外外线线8.2.1 光照对微生物的分子生态性的影响光照对微生物的分子生态性的影响 光照对微生物的影响主要体现在光合作用和紫外线两种因子上。下面主要讲解光合作用对微生物分子生态性的影响。（1）环式光合磷酸化：环式光合磷酸化能够在厌氧下利用光能。NADP+n Pi n ATPBchlBchl，hvhv（2）非环式光合磷酸化：将光合系统I和II联合起来就是非环式光合磷酸化。2NADP+2ATP+2Pi+2H2O 2NADPH+2H2+2ATP+氧气（3）绿色细菌和绿硫细菌的电子传递：也是以非环式光合磷酸化合成ATP。NAD+H2S+ADP+Pi NADPH+H+ATP+SChlChl，hvhv（4）嗜盐菌紫膜的光合作用：在光量子的驱使下，具有质子泵的作用，使质子通过细胞膜而形成ATP，同时将细胞内的盐泵出体外。这是迄今为止最简单的光合磷酸化反应。8.3 微生物在环境生物修复中的分子生态学微生物在环境生物修复中的分子生态学环境影响小环境影响小费用低费用低最大限度地降低污染浓度最大限度地降低污染浓度生物修复技生物修复技术的优点术的优点生物修复技术可以同时处理受污染的地下水和土壤生物修复技术可以同时处理受污染的地下水和土壤可处理其他技术难以应用的场地可处理其他技术难以应用的场地8.3 微生物在环境生物修复中的分子生态学微生物在环境生物修复中的分子生态学微生物不能降解所有进入环境的污染物微生物不能降解所有进入环境的污染物微生物修复只能降解特定的物质微生物修复只能降解特定的物质生物修复技生物修复技术的局限性术的局限性微生物活性受温度等环境条件的影响微生物活性受温度等环境条件的影响微生物修复需要具体考察微生物修复需要具体考察8.3.2 生物修复技术的原理生物修复技术的原理外来微生物外来微生物生物修复的微生物修复的微生物种类生物种类土著微生物土著微生物基因工程菌基因工程菌某些特定的降解需要引进外来物种，以便在极端环境中生存。降解污染物的潜力大；其生长速度慢，代谢活性不高。采用细胞融合等遗传手段将多种降解基因转入统一微生物中，使其获得较强的降解能力。价廉和易于使用。8.3.2 生物修复技术的原理生物修复技术的原理微生物法的基本原理：微生物法的基本原理：利用微生物的代谢作用，在污染场所投加成品菌株或者筛选驯化现场菌株，迅速提高污染介质中微生物浓度，在短期内提高污染物生物降解速率。特点特点多次投放现场降解能力低短期内提高降解能力8.3.2 生物修复技术原理生物修复技术原理微生物微生物生态法生态法特点：特点：评估和引用过程简单；不适合浓度过高或过低的物质；不受TSCA限制比微生物法扩散速率快。局限性：局限性：刚开始时，微生物的活性不高；当污染物浓度过高时，其有效降解能力下降；很难确定需要治理的时间。微生物生态法基本原理：调节污染物场所中微生物生存现状，加速现场微生物对有机污染物降解。8.3.2 生物修复技术的原理生物修复技术的原理溶解氧的浓度，氧是现场处理中的关键因素，能够加快污染物的生物降解。微生物活性微生物活性污染物特性污染物特性环境性质环境性质生物修复技术的影响因素生物修复技术的影响因素化学品的性质；化学品的类型；化学反应性；土壤污染数据；土壤挥发参数；降解性；土壤吸附参数。N、P是限制微生物活性的重要因素；还有共代谢基质以及电子受体等。土壤类土壤类型和场型和场地面积地面积水力学性质和状态水力学性质和状态地形和气候数据地形和气候数据土壤表面特性土壤表面特性地形和坡度地形和坡度8.3.2 生物修复技术的原理生物修复技术的原理影响现场修复影响现场修复和土壤因素和土壤因素地理和水地理和水利学因素利学因素污染现场和土壤的特性污染现场和土壤的特性 土壤特性和污染物的理化性质影响着污染物在气水两相间的相对活性，这些最终又对污染物的生物修复程度和速度发生一定的作用。8.3.3 生物修复工程技术生物修复工程技术土壤生物土壤生物修复工程修复工程原位处理原位处理挖掘堆置处理挖掘堆置处理反应器处理反应器处理 无需将土壤挖出或运输。费用少，工艺过程简单，但时间较长。是将土壤挖出来和水混合，在接种微生物在反应器中处理。传递快，便于控制，费用高，过程复杂。将污染物挖出来运到指定地点堆置进行修复处理。可限制污染的扩散，费用高，破坏生态。8.3.3 生物修复工程技术生物修复工程技术地下水生物地下水生物修复工程修复工程物理拦阻物理拦阻原位处理原位处理地上处理地上处理与土壤生物修复原理相同。将污染的地下水抽出来进行处理。去挥发物质、活性炭吸附、活性污泥和生物膜等。以物理屏障暂时阻止污染物的扩散。8.4 微生物生态学中的分子生物学技术和方法微生物生态学中的分子生物学技术和方法荧光原位杂交荧光原位杂交核酸分子杂交法核酸分子杂交法PCR扩增及产物的多态性分析及序列测定扩增及产物的多态性分析及序列测定分子生物学技术分子生物学技术分子生物学技术分子生物学技术和方法和方法和方法和方法变形梯度凝胶电泳变形梯度凝胶电泳8.4.1 荧光原位杂交荧光原位杂交采用荧光激光观察。DNA探针探针制备、标记制备、标记样品固定样品固定和脱水和脱水原位杂交原位杂交及观察及观察荧光原位杂交荧光原位杂交采用多聚甲醛固定和无水乙醇脱水（50%、80%）。采用PCR或缺口平移法制备。8.4.2 核酸分子（探针）杂交法核酸分子（探针）杂交法探测溶液中、固定在膜上、细胞或组织内的同源核酸序列。原理原理优点优点应用应用核酸分子（探针）杂交法核酸分子（探针）杂交法操作简单、反应灵敏、能得到定量的结果。利用两个不同来源的核酸链之间的互补形成杂交。8.4.2 核酸分子（探针）杂交法核酸分子（探针）杂交法不能进行克隆，不能检测突变点，但能检测特定微生物。DNA探针探针cDNA探针探针RNA探针探针寡核苷酸寡核苷酸探针探针核酸探针种类核酸探针种类指互补于mRNA的DNA分子。应用于基因表达和克隆单链分子，反应效率高。但是易降解。最常用探针，取之不尽，不易降解，标记方法多8.4.2 核酸分子（探针）杂交法核酸分子（探针）杂交法杂交方法杂交方法液相杂交液相杂交参加反应的两条核酸链游离在溶液中。操作简单，但误差大。固相杂交固相杂交一条链在固体上固定上，另一条游离在溶液中。未杂交物易去除，易检测，能阻止DNA自我复制核酸分子杂交方法核酸分子杂交方法8.4.2 核酸分子杂交方法核酸分子杂交方法主要是利用同源DNA与异源DNA复性速度不同。吸附杂交吸附杂交液相夹心液相夹心杂交杂交发光液相发光液相杂交杂交复性速率复性速率液相分子液相分子杂交杂交液相杂交法液相杂交法两个探针与靶杂交，新城夹心结构。能量传递法。只有当分子靠得很近才发生，具有高度特异性，但灵敏度低。主要有亲和、HAP、磁珠等吸附杂交法。8.4.2 核酸分子杂交方法核酸分子杂交方法SSC和SDS溶液核算探针、EDTA,6SSC、5Denhardt，变性DNA注意气泡的清除通过吸水作用将DNA吸附到膜上结果显示结果显示洗膜洗膜杂交杂交预杂交预杂交转移变性转移变性DNA到硝酸纤维膜上固定到硝酸纤维膜上固定DNA的变性解链的变性解链固相杂交过程固相杂交过程成功的关键液闪计数法、放射自显影法8.4.2 核算分子杂交方法核算分子杂交方法固相杂交方法固相杂交方法Southern以及杂交以及杂交狭缝狭缝杂交杂交斑点杂交斑点杂交夹心夹心杂交杂交组织原组织原位杂交位杂交菌落原菌落原位杂交位杂交由于前面已经介绍了固相杂交的基本过程，这些方法的具体过程原理是一样的。8.4.3 PCR扩增及产物多态性分析与序列测定扩增及产物多态性分析与序列测定对退火温度、模版浓度计循环次数优化。样品采集与样品采集与DNA提取提取引物设计引物设计与选择与选择PCR扩增扩增条件优化条件优化PCR技术注意要点技术注意要点是成功的关键，常使用针对功能基因的引物。样品能反映地点的生态性；破壁方法。PCR扩增及产物分析技术主要是进行序列的分析和片段长度多态性分析。基因指纹图谱分析基因指纹图谱分析 将产物与载体连接转入大肠杆菌，挑选出克隆的片段进性多态性分析。PCR扩增产扩增产物分析技术物分析技术序列测定及系统分析序列测定及系统分析 针对筛选出的克隆子进行核苷酸测定，依据序列进行分析、构建系统进化树。8.4.3 PCR扩增及产物多态性分析与序列测定扩增及产物多态性分析与序列测定 由于其产物是大小相同，序列不同的产物，筛选工作量大，因此常选有代表性进行克隆测定。温度梯度凝胶电泳温度梯度凝胶电泳 其与梯度凝胶的区别就是变性剂由甲酰胺/尿素变为温度梯度，其他地方都不变。DGGE的不的不同方法同方法恒变性剂凝胶电泳恒变性剂凝胶电泳 主要是对待分析片段的分离是在和该片段低温解链区相对应的变性剂浓度之下进行。8.4.4 变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGE)原理：原理：使用一种特异性的16rRNA基因，产生长度相同但序列不同的DNA片段混合物，利用DGGE技术分离。温度要求波动不超过1。变性剂浓度变性剂浓度梯度选择梯度选择凝胶的凝胶的制备制备电泳温度电泳温度DGGE注意事项注意事项均匀平整、不能有气泡。根据目标DNA片段大小及G+G含量而定。8.4.4 变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGE)